华中五味子雄花生长发育特征研究

袁小军，王 森，郭红艳，钟秋平

（1.中国林业科学研究院亚热带林业实验中心，江西 分宜 336600；2.中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室；经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004）

华中五味子Schisandra sphenanthera为多年生木质藤本植物，雌雄异株，花单性，异化授粉，分布于中国河南、陕西、江西、四川、贵州等地，生长于海拔600～1 300 m 的湿润山坡或灌丛中[1-2]，属国家三级重点保护野生药材，是重要的药食同源植物，具有广阔的市场开发前景。

开花以及花器官的发育是植物个体从营养生长向生殖发育转化的关键阶段，对物种的繁衍具有重要的影响。花发育外部形态与内部解剖结构之间存在一定的相关性，对花部结构多样性的认识是探讨被子植物系统发育的重要基础[3]。刘忠等研究了五味子属雄花形态建成的3 种类型，并讨论了五味子属植物的雄花在雄蕊形态上的原始性及其所反映的类群起源的古老性[4-5]。艾军等研究了五味子花芽分化过程中内源激素的变化[6]、花粉形态[7]、雌雄配子体[8]、授粉特性[9]的发育，对华中五味子雄花的生长发育特性等研究至今未见相关报道。因此，对华五味子雄花发育特征开展研究具有重要意义，可为研究五味子属植物的系统进化、性别分化、遗传育种和栽培管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

华中五味子的雄花采集于河南省栾川县伏牛山地区，地理坐标在111°11′～112°01′E、33°39′～34°11′N，海拔927 m，温带大陆性季风气候，年均气温12.1 ℃，年日照2 103 h，年均降水量862.8 mm；该地区有华北区系的植物、华中区系的植物和西南高寒区系的植物，土壤分为棕壤和褐土两大类。

1.2 试验方法

1.2.1 形态特征

试验植株为收集于试验地的野生华中五味子种质。2015年3—5月，在试验地中，随机选取雄花30朵花蕾，用小卡片标记，记录Ⅲ（花蕾生长期）、Ⅳ（花蕾膨大期）、Ⅴ（花冠展开期）、Ⅵ（盛开期）的生长状况。花芽萌动期至花蕾萌动期每天8:00、18:00 记录，花瓣开始分离每天8:00—18:00 隔2 h记录，花瓣开放后每天8:00—18:00 隔2 h 记录。采用SMZ—168 体视显微镜观察、测量其形态特征的变化并拍照记录。

1.2.2 结构特征

将经FAA 固定好的不同发育时期的雄花用70%的乙醇溶液冲洗5 min 后，脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、复水、染色；花柄、花瓣采用番红、固绿染色，雄蕊、雌蕊采用苏木精染色；封片后在BA410 型生物光学显微镜下观察其细胞结构，并拍照。

1.2.3 可溶性糖、蛋白质含量的测定

采集不同发育时期雌花，放进液氮罐内，带回实验室，放进-20 ℃冰箱保存备用。可溶性糖含量采用蒽酮乙酸乙酯法测定，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。

2 结果与分析

2.1 雄花发育形态特征

研究华中五味子雄花不同发育时期花部特征，研究结果见图1。华中五味子雄花Ⅲ（花蕾生长期）时期13～17 d，花瓣绿色，紧紧闭合（图1，Ⅲ-1），雄蕊群绿色（图1，Ⅲ-2），花丝绿色，花药绿色偏白（图1，Ⅲ-3），；华中五味子雄花Ⅳ时期8～ 12 d，（花蕾膨大期）花瓣绿色，边沿泛红，紧紧闭合（图1，Ⅳ-1），雄蕊群绿白两色相间（图1，Ⅳ-2），花丝淡红色，花药米白色（图1，Ⅳ-3）；华中五味子雄花Ⅴ（花冠展开期）时期2～5 d，内侧花瓣全部变红，花蕾顶部露出红色，花瓣逐渐展开（图1，Ⅴ-1），雄蕊群红白相间，红色变深，白色变白（图1，Ⅴ-2），花丝深红色，花药白色（图1，Ⅴ-3）；华中五味子雄花Ⅵ时期4～7 d，（盛开期）花瓣全部变成红色，花瓣彼此分离，花冠展开（图1，Ⅵ-1），雄蕊群红白相间，红色更深，白色变淡（图1，Ⅵ-2），花丝失水后变为淡黄褐色，花药开裂散粉后，可见明显的白色花粉，花药壁米黄色（图1，Ⅵ-3）。

2.2 雄花发育结构特征

图1 华中五味子雄花不同发育时期解剖特征Fig.1 The male flower features of Schisandra sphenanthera at different development stages by stereoscopic microscope

图2 华中五味子雄花不同发育时期花部石蜡切片Fig.2 The male flower features of Schisandra sphenanthera at different development stages by paraffin section

采用石蜡切片法对华中五味子雄花花部特征进行研究，研究结果如图2。对不同发育时期的华中五味子雄花花柄进行横切发现，不同发育时期花柄细胞结构无明显差异，由内至外分别为维管柱、皮层和表皮，无次生结构（图2，Ⅲ-8、Ⅳ-8、Ⅴ-8、Ⅵ-8）。对不同发育时期的华中五味子雄花花瓣进行纵切发现，不同发育时期花瓣细胞结构无差异，由一层表皮细胞和大量薄壁细胞组成，随着花的发育，薄壁细胞不断分裂，花瓣增厚，花瓣上存在气孔；Ⅲ（花蕾生长期）时期花瓣细胞厚456.79 μm（图2，Ⅲ-9），Ⅳ（花蕾膨大期）时期花瓣细胞厚650.70 μm（图2，Ⅳ-9），Ⅴ（花冠展开期）时期花瓣细胞厚666.80 μm（图2，Ⅴ-9），Ⅵ（盛开期）时期花瓣细胞厚685.12 μm（图2，Ⅵ-9）。对不同发育时期的华中五味子雄花雄蕊进行横切发现，不同发育时期雄蕊细胞结构差异明显，Ⅲ时期2 枚花药已初步发育形成，药隔与4 个药囊已分化形成，药隔由花粉囊壁和花粉室组成的，花粉母细胞之间、绒毡层之间以胞间连丝相连，绒毡层细胞生长旺盛，花粉母细胞已开始积累胼胝质，花粉成团存在（图2，Ⅲ-10）；Ⅳ时期2 枚花药已形成，胼胝质积累形成了胼胝质壁，胞间连丝被阻断，纤维素壁消失，绒毡层逐渐吸收，变薄（图2，Ⅳ-10）；Ⅴ（花冠展开期）中层、绒毡层完全消失，花粉发育成熟，可明显区分花粉囊和花粉囊壁（图2，Ⅴ-10）；Ⅵ（盛开期）药隔细胞形态不变，花粉囊破裂，花粉囊壁细胞失去生活力，花粉囊壁之间存在少量的花粉（图2，Ⅵ-10）。

2.3 雄花可溶性糖含量

采用蒽酮-乙酸乙酯法对华中五味子雄花Ⅲ（花蕾生长期）至Ⅵ（盛开期）花不同部位中可溶性糖含量进行测定，结果见表1。比较不同时期，雄花各部位中可溶性糖的含量发现，花柄、花瓣、雄蕊中可溶性糖含量均在Ⅵ（盛开期）时期达到最大值；Ⅳ时期花柄中可溶性糖含量高于Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ时期花柄中可溶性糖的含量，Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ时期花柄中可溶性糖含量无明显差异。随着发育时间的增加，花瓣中可溶性糖的含量逐渐增加，其中Ⅴ时期至Ⅵ时期增长最为显著，增长了37.96 mg·g-1。随着雄花发育逐渐成熟，花瓣中可溶性糖含量增加。随着发育时间的增加，雄蕊中可溶性糖的含量逐渐增加，其中Ⅳ时期至Ⅴ时期增长最为显著，增长了21.48 mg·g-1，这是雄蕊发育成熟的关键时期，花粉中开始贮藏糖等营养物质；Ⅴ、Ⅵ两时期雄蕊中可溶性糖的含量无明显差异，因雄蕊在Ⅴ时期发育成熟，随后逐渐开始散粉，因此Ⅴ时期后雄蕊中可溶性糖含量趋于稳定。

表1 华中五味子雄花不同发育时期花器官中可溶性糖含量Table1 The soluble sugar content in male flower of Schisandra sphenanthera at different development stages

比较同一时期花不同部位的可溶性糖含量发现，花柄、花瓣、雌蕊三者中，花瓣可溶性糖的含量最高，随着花的逐渐成熟，可溶性糖含量迅速增加，这是花随着生殖生长的进行，对营养物质的需求量越来越大的一种表现。

对华中五味子雄花不同发育时期花器中可溶性糖含量进行多重比较分析，结果见表2。发育时期、花部位均对其可溶性糖含量存在极显著影响 （P＜0.01)。花柄可溶性糖含量与花瓣可溶性糖含量存在极显著差异（P＜0.01)；花柄可溶性糖含量与雄蕊可溶性糖含量存在极显著差异 （P＜0.01)；花瓣可溶性糖含量与雄蕊可溶性糖含量差异未达显著水平。Ⅲ时期花器官可溶性糖含量与Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ时期可溶性糖含量差异达极显著水平（P＜0.01)；Ⅳ时期花器官可溶性糖含量与Ⅲ、Ⅵ时期可溶性糖含量差异达到极显著水平 （P＜0.01)，与Ⅴ时期化器官可溶性糖含量差异未达显著水平；Ⅴ时期化器官可溶性糖含量与Ⅲ时期可溶性糖含量差异达极显著水平（P＜0.01)，与Ⅳ、Ⅵ时期化器官可溶性糖含量差异未达显著水平。

表2 华中五味子雄花不同发育时期各器官中可溶性糖含量多重比较（表格中未标出多重比较结果）†Table2 The multiple comparisons in male flower soluble sugar of Schisandra sphenanthera at different development stages

2.4 雄花可溶性蛋白含量

采用考马斯亮蓝G-250 法对华中五味子雄花Ⅲ（花蕾生长期）至Ⅵ（盛开期）花不同部位中可溶性蛋白质进行测定，结果见表3。比较同一花部不同发育时期可溶性蛋白质的含量发现，随着发育时间的增加，Ⅲ时期至Ⅴ时期花柄中可溶性蛋白质的含量逐渐降低，随后升高；随着发育时间的增加，Ⅲ时期至Ⅴ时期瓣中可溶性蛋白质的含量逐渐降低，随后升高；随着发育时间的增加，Ⅲ时期至Ⅵ时期雄蕊中可溶性蛋白质的含量逐渐降低。比较不同花部同一发育时期的可溶性蛋白质含量发现，Ⅲ时期雄蕊中可溶性蛋白质含量最高，分别高于花柄、花瓣1.24 mg·g-1、5.73 mg·g-1；Ⅳ时期花柄中可溶性蛋白质含量最高，分别高于花瓣、雄蕊 4.78 mg·g-1、11.42 mg·g-1；Ⅴ时期雄蕊中可溶性蛋白质含量最高，分别高于花柄、花瓣1.24 mg·g-1、0.28 mg·g-1；Ⅵ时期花柄中可溶性蛋白质含量最高，分别高于花瓣、雄蕊7.22 mg·g-1、5.84 mg·g-1。

表3 华中五味子雄花不同发育时期花器官中可溶性 蛋白质含量Table3 The soluble protein in male flower of Schisandra sphenanthera at different development stages

对华中五味子雄花不同发育时期花器中可溶性蛋白质含量进行多重比较分析，结果见表4。发育时期、花部位均对其可溶性蛋白质含量存在极显著影响（P＜0.01)。花柄中可溶性蛋白质含量与花瓣中可溶性蛋白质含量存在极显著性差异 （P＜0.01)；花柄中可溶性蛋白质含量与雄蕊中可溶性蛋白质含量差异未达显著水平；花瓣中可溶性蛋白质含量与雄蕊中可溶性蛋白质含量差异达极显极著水平（P＜0.01)。Ⅲ时期各花部中可溶性蛋白质含量与Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ时期各花部中可溶性蛋白质含量差异达极显著水平（P＜0.01)；Ⅳ时期各花部中可溶性蛋白质含量与Ⅲ时期各花部中可溶性蛋白质含量差异达极显著水平 （P＜0.01)，与Ⅴ、Ⅵ时期各花部中可溶性蛋白质含量差异未达显著水平；Ⅴ时期各花部中可溶性蛋白质含量与Ⅲ各花部中可溶性蛋白质含量差异达极显著水平（P＜0.01)，与Ⅳ、Ⅵ时期各花部中可溶性蛋白质含量差异未达显著水平。

表4 华中五味子雄花不同发育时期各器官中可溶性 蛋白质含量多重比较Table4 The multiple comparisons in male flower soluble protein of Schisandra sphenanthera at different development stages

3 结论与讨论

对于进行有性生殖的雌雄异株植物，雄株开花传粉是完成生殖繁衍的必要条件。杜庆鑫[10]认为传粉特性是影响花冠形态的最有效因素，两者相辅相成；肖乐希[11]等对华凤仙Impatienschinensis的研究认为华凤仙的花部特征与其蜂媒传粉密切相关；王红[12]等对马先蒿属Pedicularis花冠形态的研究，其认为传粉者的选择是影响花冠类型的重要因素，花冠形态与传粉式样存在紧密的协同进化关系。郁文彬[13]等对马先蒿属植物花冠形态的研究认为，花冠的多样性与传粉行为关系密切。王茜等对雌雄异株的钝叶柃的研究表明，不同性别花的花部形态和传粉特征既有一些共同点，又存在着明显差异，性别变异株则呈现出雌雄植株间的过渡特征[14]。邓洪平等对雌雄异株的北碚榕的研究表明，雌雄植株在形态构上差异显著，雄花形态与传粉昆虫形态一致，雄花序内部雄花发育的时期与传粉小蜂的羽化成熟时期保持一致[15]。华中五味子雄花开花过程中花冠下垂并朝向地面，花瓣不完全展开，颜色艳丽，花粉在花冠展开期发育成熟，这些特征与虫媒传粉特征相适应。以昆虫为主的虫媒传粉植物，在昆虫的传粉过程中，被传粉植物既要昆虫帮助其完成传粉来保证其本身的物种延续，又要尽可能地减少传粉过程中的伤害[16]；昆虫在传粉的过程中，通常咬食花部器官或者吸食花蜜[17]。华中五味子雄花花托、花丝、药隔肉质增厚，是长期受昆虫咬食带来的繁育压力而进化的结果，同时在调查时也发现花瓣、雄蕊有被咬食的情况，这可能与其传粉特性相关。

在植物开花的过程中，需要大量的营养物质，而光合作用产生的营养物质主要以糖分的形式积累，研究发现糖类物质不仅是能量的供应者，也直接参与花芽分化的调节过程。Kinet[18]对桂香竹的研究结果表明，花春化期间，顶芽可溶性糖含量增加。目前国内外学者[19-20]关于花与可溶性糖、可溶性蛋白质含量间的关系研究大多为开花期间，叶片、根、茎中可溶性糖、蛋白质含量的变化[21]；关于关于花本身可溶性糖、蛋白质含量与其形态发生的关系研究较少，毕平等对枣花的研究认为内源激素水平对枣品种的坐果起主导作，而营养状况对生理落果起主导作用，但并未阐明营养状况与开花的关系。本研究发现，华中五味子雄花花瓣、花柄上均有气孔，这说明花本身可进行光合作用产生营养物质供其生殖生长。华中五味子雄花不同发育时期，雄花花柄、花瓣、雄蕊中可溶性糖含量均在Ⅵ（盛开期）时期达到最大值；华中五味子同一发育时期不同部位中，雄花花瓣中可溶性糖含量最高。华中五味子不同发育时期，雄花花柄、花瓣、雄蕊中可溶性蛋白质含量先降低后升高；同一发育时期不同花部，雄花花柄、雄蕊中可溶性蛋白质含量相对较高。对比不同发育时期、不同花部中可溶性糖和可溶性蛋白质含量发现，当可溶性糖含量相对较高时，可溶性蛋白质含量相对较低，当可溶性糖含量相对较低时，可溶性蛋白质含量相对较高。花瓣是花部营养物质的合成场所，而蔗糖是光合作用主要的末端产物，也是光合产物从合成场所向各器官移动的主要形式，雌蕊是雌花所需营养物质最多，发育时间最长，完成生殖生长的关键部位，因此花瓣、雌蕊中可溶性糖的含量高于其他部位。当花发育到Ⅴ（花冠展开期）时期时，花部生长对营养物质的需求量开始降低，可溶性糖含量也开始降低。在植物的生长发育过程中，蛋白质的合成主要发生在细胞质和线粒体中，它参与许多不同的细胞功能，雄蕊是主要的生殖器官，因此雄蕊中蛋白质的含量高于其他部位。