栀子苷对糖尿病肾病小鼠的改善作用

陈君第霞，潘晓琼，禹博威，胡臻

（温州医科大学附属第二医院 中医科，浙江 温州 325027）

糖尿病是一类由糖代谢紊乱而引起的以长期高血糖为主要特征的代谢性疾病，可导致多种并发症，包括糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）、视网膜病变、心血管疾病及神经损伤等[1-2]。随着社会的发展、人口老龄化以及生活方式的改变，糖尿病的发病人数呈迅猛增长的趋势，已经成为21世纪人类健康的最大威胁之一。DN是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是终末期肾脏病的主要原因之一[3]。蛋白尿、高血压、肾小球滤过率降低是DN的主要临床表现[4]。大量研究表明炎症与DN的病理发展密切相关[5-6]。因此，有效改善糖尿病炎症状态成为防治DN的重要措施之一。

栀子苷，也称栀子甙（geniposide），是一种环烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是栀子中主要活性成分[7]。近年，越来越多的临床、动物及细胞实验证明栀子苷具有抗炎[8]、抗氧化[9]、降低血糖[10]、神经保护[11]、保肝利胆[12]等多种生物学活性，并引起医学界的高度重视。研究表明，栀子苷可以通过激活Nrf2 信号通路抑制脂多糖诱导的BV2 小胶质细胞炎症反应，降低肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）蛋白表达[13]。栀子苷能有效降低脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中炎症状态下TNF-α和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等的表达和释放[14]。目前栀子苷缓解DN炎症状态的研究较少，本研究拟利用链脲佐菌素（streptozocin，STZ）建立1型糖尿病小鼠模型，观察栀子苷对改善DN损伤的作用效果，为DN提供新的治疗方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：32只SPF级C57BL/6J小鼠雄性（6～8周龄），体质量18～22 g，由温州医科大学实验动物中心提供，实物动物许可证号：SCXK（浙）2015-0001。

1.1.2 主要试剂：栀子苷（纯度＞98%）购自上海莫奇生物科技有限公司，STZ购自美国Sigma公司，血糖仪及血糖试纸购自瑞士罗氏公司，TRIzol、反转录试剂盒、RNA提取试剂盒和荧光定量试剂盒购自美国Inritrogen公司，TNF-α、IL-6、IL-1β和β-actin引物购自美国Invitrogen公司，HE染色试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.1.3 主要设备：荧光正置显微镜（日本Nikon公司），HM340E半自动轮转切片机（美国Thermo Fisher Scientific公司），TPJ-A型摊片机、TPJ-A型烘片机（常州中威电子仪器有限公司），艾本德高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），T100型梯度PCR仪、CFX96实时荧光定量PCR仪（美国Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病动物模型的建立：SPF 级雄性C57BL/6J小鼠36只，适应性饲养1周后，随机抽取28 只小鼠作为造模小鼠，剩余8 只小鼠作为正常组。0.1 mol/L枸橼酸缓冲液（pH为4.5）溶解STZ，配制成1%的STZ（配置过程冰浴避光，现配现用）。造模前小鼠禁食不禁水12 h，造模小鼠以每天50 mg/kg STZ进行腹腔注射，连续5 d，正常组小鼠以等量0.9%氯化钠溶液进行腹腔注射。注射药物后每7 d在小鼠尾静脉取血，用快速血糖仪测小鼠空腹6 h后血糖，连续2次≥13.9 mmol/L者为造模成功小鼠[15]。

1.2.2 分组和给药：28只造模的小鼠中，有24只造模成功，将其随机分为模型组、栀子苷低剂量组（100 mg/kg）和栀子苷高剂量组（200 mg/kg），每组8只。栀子苷处理组以不同剂量栀子苷，模型组和正常组均以等量0.9%氯化钠溶液每天灌胃，连续给药8周。

1.2.3 一般情况记录以及血糖、体质量的测量：实验期间观察并记录各组小鼠的精神状态、活动反应、毛色情况、饮食饮水量、垫料潮湿情况以及大便情况，每2周测量并记录小鼠血糖和体质量。

1.2.4 标本采集：给药8周后，采用10%水合氯醛麻醉小鼠，切开腹腔迅速摘取肾组织，分装标本，部分于-80 ℃冰箱保存备用，部分于4%中性甲醛溶液中固定备用。

1.2.5 肾脏组织形态学检查：肾脏组织置于4%中性甲醛溶液中24 h后，流水冲洗过夜，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，按照HE染色试剂说明书操作，光镜下观察肾脏组织形态学变化，重点观察肾脏炎症细胞浸润情况。

1.2.6 RT-qPCR法检测小鼠肾脏组织TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表达：用TRIzol法提取肾脏组织总RNA，按照反转录试剂盒步骤，以RNA为模板合成cDNA。参照荧光定量PCR试剂盒说明书，以β-actin为内参，进行PCR反应，采用实时荧光定量PCR仪进行定量分析肾脏组织内TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的含量。所用小鼠基因的引物序列见表1。

1.3 统计学处理方法 采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 RT-qPCR引物序列

2 结果

2.1 4组小鼠生存状态记录 给药期间正常组小鼠生活状态良好；模型组小鼠出现不同程度的活动减少，毛色欠光泽，易脱落，多食、多饮、多尿症状，垫料潮湿，体质量增长缓慢等现象；随着实验灌胃给药的进行，栀子苷低、高剂量组小鼠上述症状较模型组有所改善。

2.2 栀子苷对4组小鼠体质量的影响 正常组小鼠体质量稳步增长，栀子苷低、高剂量组和模型组的体质量明显低于正常组（P＜0.01）。随着栀子苷的干预治疗，给药8周后，栀子苷低剂量组和模型组小鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05），栀子苷高剂量组小鼠体质量较模型组明显增多（P＜0.05），见图1。

图1 栀子苷对4组小鼠体质量的影响（每组n=8）

2.3 4组小鼠空腹血糖比较 正常组小鼠空腹血糖波动稳定，栀子苷低、高剂量组和模型组空腹血糖明显高于正常组（P＜0.01）。随着栀子苷的干预治疗，给药8周后，模型组空腹血糖仍维持在较高的水平，栀子苷低剂量和高剂量组小鼠的空腹血糖水平降低，高剂量组小鼠空腹血糖较模型组明显下降（P＜0.01），见图2。

图2 栀子苷对4组小鼠空腹血糖的影响（每组n=8）

2.4 4组小鼠肾脏组织形态比较 栀子苷干预治疗8周后，正常组小鼠肾小球形态和结构正常，毛细血管袢完整，球内系膜细胞数量正常，肾小管形态良好，间质未见明显炎性细胞浸润。模型组小鼠肾小球毛细血管袢受损形变，系膜细胞减少，小叶分隔增宽，呈分叶状，肾小管上皮细胞萎缩、坏死、管腔变大，肾间质大量炎性细胞浸润。栀子苷低剂量和高剂量组小鼠肾组织病理损伤有很大程度上缓解，血管球形态有一定恢复，系膜细胞增多，肾小管形态结构清晰，肾间质炎性细胞明显减少，见图3。

2.5 4组小鼠肾脏组织TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA相对表达量比较 栀子苷干预治疗8周后，与模型组相比较，栀子苷低剂量和高剂量组肾组织中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4。

3 讨论

栀子作为我国的传统中药，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒、消肿止痛等作用。传统临床中常用于治疗热病心烦、湿热黄疸、淋证涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡等病变，近几十年逐渐将其运用到糖尿病及其并发症的治疗中。从栀子果实中提取的的环烯醚萜类化合物栀子苷具多种生物学活性。栀子苷能够保护糖尿病小鼠胰岛结构，促进β细胞增殖，增加胰岛素分泌，从而降低血糖[16]。栀子苷可以降低脓毒血症小鼠血清促炎因子表达水平，缓解多器官功能障碍状态[8]。本研究探讨栀子苷能否改善STZ诱导的DN小鼠炎症状态，从而保护肾组织。糖尿病小鼠连续灌胃8 周，每日1次，栀子苷低剂量组和栀子苷高剂量组能有效增加小鼠体质量，降低血糖，且呈剂量依赖性。但栀子苷低剂量组和栀子苷高剂量组血糖值仍旧远高于正常组，这可能与栀子苷剂量不足有关。给药8周后，栀子苷低剂量组和栀子苷高剂量组小鼠肾组织血管球形态有一定恢复，系膜细胞增多，肾小管形态结构清晰，肾间质炎性细胞浸润明显减少，说明栀子苷能有效缓解小鼠肾组织病理损伤，改善小鼠的DN状态。

图3 4组小鼠肾组织病理切片HE染色结果（×200）

图4 4组小鼠肾组织中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的相对表达量（每组n=8）

越来越多的证据表明，持续低度炎症反应状态对DN的发生及发展过程具有重要影响[17]。TNF-α、IL-6 和IL-1β是重要的促炎因子，这些因子的过度分泌促进了中性粒细胞聚集和激活，进而向炎症部位迁移、吞噬细胞、释放卵清蛋白酶、产生活性氧和促进细胞凋亡等，促进糖尿病相关炎症进展，导致糖尿病患者的免疫紊乱[18-19]。本研究结果显示，栀子苷干预治疗8周后，与模型组相比较，栀子苷低剂量和高剂量组TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达显著下降，且呈剂量依赖性。说明栀子苷可以降低DN小鼠炎症相关RNA表达，减弱炎症状态，为进一步炎症分子机制研究提供依据。

综上所述，栀子苷能有效改善小鼠的DN状态，降低血糖，保护肾组织，其调控机制可能与其能改善糖尿病小鼠炎症状态有关，但具体炎症分子机制有待研究。