载锌凹凸棒石对3种猪常见致病菌的体外抑菌效果

孙文恺 刘强 刘洋 庄苏

摘要 [目的]探究载锌凹凸棒石对大肠杆菌、沙门氏菌与金黄色葡萄球菌3种致病菌的体外抑菌效果。[方法]采用固相离子交换法制备载锌凹凸棒石，采用平皿二倍稀释法测定载锌凹凸棒石和热活化凹凸棒石对大肠杆菌、沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）。[结果]热活化凹凸棒石对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均无抑菌作用，而载锌凹凸棒石对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为60.00、17.50和15.00 mg/mL，对应锌浓度分别为1.21、0.35和0.30 mg/mL。[结论]载锌凹凸棒石是一种良好的抗菌剂。

关键词 载锌凹凸棒石;致病菌;最小抑菌浓度

中图分类号 S859.79 +6文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0085-04

Abstract [Objective] To investigate the bacteriostatic effect of Zincloaded palygorskite（ZnPal）on Escherichia coli， Salmonella sp. and Staphylococcus aureus in vitro. [Method] ZnPal was prepared by solidstate ion exchange method. Minimum inhibitory concentrations （MIC） of ZnPal and heated palygorskite（Pal）to E.coli， Salmonella sp. and staphylococcus aureus were determined by plate double dilution method. [Result] Pal had no antibacterial effect，and the minimum inhibitory concentrations of ZnPal to E.coli， S.sp. and S.aureus were 60.00， 17.50 and 15.00 mg/mL respectively，corresponding zinc concentrations were 1.21， 0.35 and 0.30 mg/mL， respectively. [Conclusion] Zincloaded palygorskite was a good antibacterial agent.

Key words Znicloaded palygorskite;Pathogenic bacteria;Minimum inhibitory concentration（MIC）

抗生素在畜牧业中使用可以起到防治细菌性疾病、促进动物生产生长等作用，但长期使用会使动物产生细菌耐药性、免疫抑制、抗生素残留等问题，并对环境造成严重污染[1]，同时给食品带来安全问题。针对这些问题，有关国家及组织相继出台在饲料中禁用抗生素相关法规。我国农业农村部先后2次发布禁止在食品动物中使用硫酸黏菌素等4种兽药。2019年3月1日农业农村部畜牧兽医局在关于征求《药物饲料添加剂退出计划（征求意见稿）》意见的函中指出：自2020年1月1日起，除中药外所有促生长药物饲料添加剂产品质量标准废止，2020年7月1日起饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料。因此，寻找抗生素替代品已成为畜牧生产中的一个研究热点。抗生素替代品种类繁多，其中无机抗菌剂则是诸多抗生素替代品中的成员之一。无机抗菌剂是指具有抗菌能力的银、铜、锌等金属及其离子和化合物或上述物质与不同载体（沸石、黏土和磷酸盐等）结合而获得抗菌作用的抗菌剂[2]，具有抗菌谱广、活性持久、稳定性好与不产生抗药细菌等特点。凹凸棒石是一种以纤维状形式存在的天然水合硅酸镁铝矿物质[3]，因其具有吸附性好、化学性质稳定且持久缓释等优点而成为一种优良的抗菌剂载体[4]。锌是目前确认生理功能最多的微量元素，除具备生理功能之外，还可以通过影响细胞代谢达到抑制细菌生长的作用[5]。已有研究表明载锌蒙脱石对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌作用[6]，载铜凹凸棒石对沙门氏菌具有抑菌作用[7]。笔者采用固相熔盐离子交换法的方法制备载锌凹凸棒石，研究其对猪致病性大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果，以期为载锌凹凸棒石作为抗生素替代品在动物生产实践中的使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料與试剂

试验用凹凸棒石由江苏金泰源生物科技有限公司提供;大肠杆菌由南京农业大学动物科技学院生物饲料实验室提供;金黄色葡萄球菌和沙门氏菌由南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心提供;LB液体培养基、LB固体培养基及麦康凯培养基均购于南京杰汶达生物科技有限公司。

1.2 仪器

HZ-9211SB型恒温振荡器（太仓市华利达实验设备有限公司）;BS210S型分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）;YXQ-LS-30SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司）;PYX-DHS-40×50隔水式恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）;SW-CJ-1D型超净工作台（上海苏净实业有限公司）;UV-1200型紫外分光度计（上海美谱达仪器有限公司）;TDZ4-WS低速自动平衡离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）

1.3 试验方法

1.3.1 最小抑菌浓度（MIC）的测定。MIC的测定采用平皿二倍稀释法[8]。

1.3.1.1 热活化凹凸棒石（Pal）和载锌凹凸棒石（Zn-Pal）的制备。参考颜瑞[9]的方法，将凹凸棒石置于300 ℃马弗炉活化3 h后即得到热活化凹凸棒石。将热活化后的凹凸棒石与氯化锌按4∶1的质量比混合均匀后，经处理制成载锌凹凸棒石，经测定其负载锌量为20.19 mg/g。

3 討论与结论

无机抗菌剂通常是通过物理吸附或离子交换等方法将本身具有抗菌能力的银、铜、锌等金属或其离子固定在沸石、硅胶等多孔材料表面从而制得抗菌剂，具有广谱抗菌性、抗菌时效长、安全性高、稳定性高等优点，被广泛应用到各领域[10]。国内外研究表明，金属无机抗菌剂对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等病原菌具有高效的抗菌性能[6，9，11- 12]。该试验结果表明，载锌凹凸棒石对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果，MIC分别为60.00、17.50和15.00 mg/mL，锌浓度分别为1.21、0.35和0.30 mg/mL。颜瑞[9]研究表明，载锌凹凸棒石对大肠杆菌的MIC为17.50 mg/mL（锌浓度为0.83 mg/mL），该试验MIC高于颜瑞[9]的测定结果，究其原因可能与试验条件、菌株来源有关。该试验结果还表明热活化凹凸棒石对3种致病菌均无抑菌作用，与Maryan等[13]研究发现天然蒙脱石仅对细菌有吸附作用并无抑制效果或者杀菌作用相似，说明试验抑菌作用来自锌元素。该试验还发现，3种致病菌在进入快速生长对数期后存在差异，添加载锌凹凸棒石试验组菌体生长曲线不再随时间的变化而变化，证明载锌凹凸棒石能抑制菌体生长，且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果。

金属无机抗菌剂发挥抑菌作用主要是由金属离子的杀菌能力，而载体主要是对细菌有吸附作用，吸附效果取决于硅铝酸盐矿物质较大的比表面积、多孔道结构、阳离子交换能力和表面功能基团，经过热处理后的凹凸棒石可以通过移除其表面水以及部分配位水来增大比表面积，从而提高其吸附性能[14-15]。天然硅铝酸盐矿物质本身带有负电荷，对细菌的吸附能力相对较弱，但经过金属离子改性后带正电荷并改善表面的亲疏水性，通过氢键和静电作用吸附病原菌至载体表面[16-18]。该试验通过固相熔盐离子交换法制得载锌凹凸棒产品，使得带正电的锌离子可以与呈负电性的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜通过库仑引力牢固的吸附在一起，致使细胞壁破裂，导致细胞质外流，抑制细菌繁殖，从而导致细菌死亡起到杀菌作用[19-21]，从而增强锌的抑菌效果。该试验结果表明，热活化凹凸棒石对3种致病菌无抑菌作用，载锌凹凸棒石具有较强的抑菌作用，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为60.00、17.50和15.00 mg/mL，对应锌浓度分别为1.21、0.35和0.30 mg/mL。

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