塞尼卡病毒A研究进展

包松英

福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

SVA最早被发现时，曾被当作细胞培养基的污染物，命名为SVV-001。起初发现SVV-001的保守多肽区（P1、2C、3C、3D）与小 RNA 病毒科心病毒属关系最为密切，但其它区域与心病毒属有很大不同，比如核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site，IRES）不同，2A蛋白酶长度不同，2B和3A多肽明显不同等。因此，SVA被归属于小RNA病毒科（Picornaviridae）一个新的属叫塞尼卡病毒属（Senecavirus）[1]。 该病毒具有溶瘤特性，可优先感染肿瘤细胞，现已被应用于人类多种神经内分泌肿瘤治疗试验[2-4]。该病毒可感染猪引起水泡病变，严重危害养猪业发展。本文阐述SVA研究进展，以帮助相关工作者了解防控该病毒病。

1 病原特性

SVA是无囊膜的单股正链RNA病毒，是直径约27 nm的二十面体颗粒。SVA仅有一个血清型，病毒全长7 280 nt，5'UTR端的IRES与黄病毒属的丙型肝炎病毒和猪瘟病毒在结构和功能上相似[5]。666 nt长的5'UTR后面跟着一条6 543 nt的开放阅读框 （Open Reading Frame，ORF）， 该 ORF 编码含2 181个氨基酸的多聚蛋白，其被切割为12个多肽，是标准小RNA病毒L-4-3-4结构。一条71 nt的3'UTR后跟着一个未知长度的ployA尾。病毒基因组由前导蛋白（L）和三个主要的蛋白质区域组成（见图 1），分别为 P1、P2、 P3。其中 P1 区域裂解为构成病毒衣壳的结构多肽VP0、VP3和VP1，成熟的VP0裂解成VP2和VP4多肽。VP1、VP2、VP3表达于核衣壳外表面，VP4表达于核衣壳内表面。VP1～VP4亚基的整体三级结构是保守的，VP1和VP2可能介导病毒的细胞嗜性，VP2和VP4可能参与核酸包装[1,6]。

SVA的P2和P3区域参与编码非结构多肽。P2区域被分割成2A、2B、2C。2A蛋白是一种短肽，由9个氨基酸组成，以NPG/P保守基序结尾，具有预测的核糖体跳过功能。2B蛋白具有类似孔蛋白的作用，2C蛋白是一种螺旋状多肽，参与RNA合成。P3区域含有多肽3A、3B、3C、3D，3A功能尚不可知；3B编码一个VPg蛋白，在RNA合成过程中起到类似启动子的作用；3C是一种蛋白酶；3D多肽是RNA依赖RNA聚合酶的主要成分[1]。

图1 SVA基因组结构示意图[7]

2 机体免疫应答

体液免疫和细胞免疫共同参与了机体抗SVA感染过程。Maggioli等[8]通过接种15周龄猪发现：SVA在感染早期可刺激机体产生中和抗体，中和抗体水平的升高和猪只水泡病变的消退一致，中和抗体水平与病毒载量呈负相关，证实了中和抗体在SVA早期感染中的重要作用。进一步研究血清中抗体发现：血清中IgM抗体出现较早（第3 d），且抗体水平与中和抗体效价呈显著正相关。IgM应答主要是针对VP2和VP3，对VP2和VP3的免疫应答与中和抗体水平呈高度相关性。IgG抗体消长类似IgM，IgG出现较晚，且抗体水平较低。同样，随着疾病的消退，抗VP2和VP3的IgG水平下降，而在第35 d检测不到针对这两种蛋白的抗体，但到第35 d依然能检测到不同水平的VP2特异性IgG抗体，暗示其可能参与感染35 d后的中和反应。细胞免疫方面研究发现：在SVA感染早期，CD4+T细胞反应比CD8+T细胞反应更早被检测到，CD4+T细胞活性的增加与病毒血症的降低同步。此外，CD4+T细胞的反应也与IgG、IgM及中和抗体水平的峰值相一致，因此可知CD4+和CD8+T细胞可能在一定程度上有助于控制SVA感染。

3 国内外流行现状

3.1 国外SVA流行现状 美国早在1988-2005年就从临床有水泡症状的猪身上分离到一种未知的小RNA病毒，后经证实为SVA，说明该病毒在美国存在已久[9]。2015-2017年，美国各地猪场相继出现SVA疫情[10-13]。加拿大于2007年首次报道在猪群中分离到SVA[14]，当时对该病毒研究较少，并不能确定其致病性。2015年初，巴西六个州暴发了猪水疱病疫情，官方诊断显示并非传统的水疱病病原，自断乳和成年猪的水疱液和拭子以及破裂的水疱刮伤和溃疡性病变样本中监测到SVA核酸呈阳性，而临床健康的猪均未检出该病毒；测序分析显示，与SVV-001和北美SVA呈现高核苷酸（87.6%～98.5%）和氨基酸 （95%～99.4%）同源性。因此，SVA是该猪群中水疱病暴发的病原[15]。Saporiti等[16]收集了巴西2007-2016年23个猪场血样，测定中和抗体，发现在2014年前均未检测到SVA抗体，2014年及之后的247个样品中，有36.4%的样品呈现高滴度中和抗体（≥64），其中发病场样品中65.7%出现高滴度中和抗体，预示着SVA已在巴西境内多个州出现流行。除了美洲之外，泰国也于2016年首次报道SVA疫情，泰国SVA分离株与加拿大第一株菌株 （11-55910-3）关系密切[17]。

3.2 国内流行现状 2015年3月起，在广东某些猪场陆续发生水泡性疾病，主要临床症状为：母猪发烧厌食、口鼻及蹄部出现水泡，并伴有产房仔猪急性死亡，在排除常见水泡病病原口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）、猪水泡病病毒（Swine Vesicular Disease Virus，SVDV）、水泡性口炎（Vesicular Stomatitis Virus，VSV） 等后， 确诊为 SVA感染[18]。2016年，湖北报道了第二例SVA感染，Qian等[19]从出现水泡症状的仔猪膀胱病变组织样本中分离并鉴定了一株SVA HB-CH-2016株。

目前，SVA病毒感染在我国较为普遍，至少14个省份检测到SVA感染，除了发病猪场外，屠宰场也有不同程度污染，其中福建、湖北等省份SVA污染面较广。中国动物卫生与流行病学中心检测发现，在外观健康的猪群中可以检测到11.2%比例的SVA阳性样品，说明SVA感染在猪群中较为常见，这将更利于SVA的传播和扩散[20]。

值得注意的是，以2016年为转折点，中国SVA分离株已经形成两个明显的亚支。从中国东北地区表现出水泡病的1头猪身上分离到的SVA/HLJ/CHA/2016菌株与2015年美国菌株的亲缘关系较近，而与中国其他菌株的亲缘关系较差；2017年，从福建省某养猪场母猪和肥育猪再次出现水泡病的病例中分离到的新SVA株CH-FJZZ-2017与2015年的美国菌株密切相关，与2016年末分离的其他菌株之间存在一定的进化距离[21-22]。Zhao等[23]对广东不同猪场的7个SVA分离株进行了鉴定，其中变异最大的分离株CH-DL-01-2016包含一个位于219-220位点的单氨基酸插入和一个位于250-251位点的16个氨基酸插入，与GenBank获得的31个SVA VP1序列相比，VP1蛋白也有4个核苷酸的变化，这些病毒进化特点需要引起重视。

3.3 传播途径 SVA的传播途径尚不明确。养殖场内该病毒的可能传播途径有：农场内人员出入农场、动物尸体处理、母猪淘汰、后备种猪引入，养殖场内其他养殖动物、啮齿类、其他访客、饲料发运、断乳仔猪转栏、精液使用等[24]。

4 临床症状与病理变化

成年猪感染SVA的主要特征为厌食、跛行，在鼻部、唇部、蹄冠部、趾间、悬蹄等部位出现皮肤损伤，这些皮肤损伤最初为发白的肿胀区域，并逐渐发展为小泡，之后囊泡迅速破裂，形成溃疡。溃疡在7 d后开始修复，临床症状逐渐缓解，病程1～2周[7,12-13]。仔猪感染后主要症状为水样腹泻，肾脏出血点，肺部水肿、充血，蹄冠部水泡等[25]。SVA可侵袭新生仔猪多个器官，尤其是扁桃体、脾脏、肺和肝脏，淋巴器官的病毒载量最高，可能是SVA复制的重要部位[26]。SVA能引起新生仔猪死亡，不同地区、不同饲养环境死亡率不尽相同[10,13,27]。有报道称，SVA与流行性暂时性新生仔猪损失 （Epidemic Transient Neonatal Losses，ETNL） 有关，Oliveira 等[25]研究了54头1～10日龄出现ETNL的仔猪，其中81%仔猪死亡，死亡仔猪年龄为2～5日龄，说明SVA的临床表现在新生仔猪中更为强烈，因为仔猪在出生时免疫系统不成熟，容易出现急性死亡。据估计，巴西巴拉那州和圣塔卡塔琳娜州因SVA引起的仔猪死亡率为20%～30%[28]，在米纳斯吉拉斯州和戈伊西亚州为 30%～70%[27]。

人为接种SVA于不同年龄猪，可更直观看到SVA感染的临床症状。15周龄猪，接种SVA第4 d时，皮肤出现红斑，之后变成直径0.5～3 cm的小泡，在第5～10 d，囊泡破裂，导致皮肤糜烂，大多数病变在第14 d完全消除[8]。育肥猪接种（5×108.07TCID50）SVA临床分离毒株（SD15-26）后，在第4 d出现嗜睡和跛行等症状，并持续2～10 d，鼻部和蹄部在第4 d出现水泡病变，水泡主要分布在蹄冠部、悬蹄、趾间隙以及蹄底部等；第3～10 d可见短暂的病毒血症，第1～28 d口腔、鼻腔分泌物和粪便中出现排毒；在肺、淋巴结、肝、脾、小肠、大肠与扁桃体等部位都可以检测到SVA。值得注意的是，RT-qPCR和核酸原位杂交试验在第38 d所有SVA感染动物的扁桃体中都可检测到SVA核酸，说明SVA可能有淋巴组织嗜性，在扁桃体内有更高水平的病毒含量[29]，与Agnol等在仔猪的SVA感染中观察到的结果相符[26]。

该病毒可引起新生仔猪出现移行上皮细胞空泡变性、非化脓性脑膜脑炎、脉络丛炎、萎缩性肠炎。半薄切片分析显示，小肠顶端肠细胞空泡化，脉络丛内皮细胞变性坏死，非化脓性脉络丛炎。超薄切片检测结果显示，肠上皮细胞水样变性，CP孔状毛细血管内皮变性坏死，室管膜细胞变性伴细胞内病毒颗粒。SVA可诱导10日龄内的仔猪出现多系统衰竭，从而导致新生仔猪死亡[25]。

5 诊断技术

从临床症状上来看，SVA感染引起的水泡病变易与FMDV、SVDV、VSV等病毒引起的病变混淆[7]。因此，实验室诊断是鉴别SVA的重要手段。

5.1 血清学检测 Yang等[30]针对SVA制备了特异性单克隆抗体，开发了一种竞争性酶联免疫吸附试验（Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，cELISA）方法，经验证，该方法的诊断特异性和敏感性分别为 98.2%（97.2%～98.9%）和 96.9%（94.5%～98.4%）；Goolia[31]还建立一种病毒中和试验（Virus Neutralization Test，VNT）方法，其诊断特异性和敏感性分别为99.6%（99.0%～99.9%）和 98.2%（95.8%～99.4%）。 基于 kappa系数计算，cELISA、VNT和间接免疫荧光法 （Indirect Fluorescent Antibody Test，IFAT）之间具有较强的一致性，三种方法均可用于SVA的血清学检测，cELISA方法更利于临床推广使用。

5.2 PCR检测 SVA核酸快速检测，对有效监控和防治该病具有重要作用。目前已有针对不同基因序列的RT-PCR方法的研究。Agnol等[32]开发了一个特异性qRT-PCR方法能够检测和量化猪生物样本中 SVA的 RNA，检测限值可达 13 copies/μL，该方法对组织病料的检出率高于传统RT-PCR方法。刘健新等[33]以SVA VP1基因保守序列设计引物，建立了实时荧光定量RT-PCR检测方法，并对其进行特异性、敏感性和重复性评价，结果显示，该检测方法特异性好，灵敏度达10 copies/μL，变异系数均小于2.0%，操作简单，耗时短。樊晓旭等[34]针对病毒保守的3D基因区域设计并筛选出引物和TaqMan探针组合建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法，检测灵敏度可达2.8 copies/μL，检测结果可在2 h内得出。

鉴于SVA引起猪的水泡病变易与FMDV的临床症状混淆，刘涛等[35]针对SVA的VP1基因和FMDV的5'UTR基因，合成了特异性的引物，设计了SVA和FMDV双重RT-PCR检测方法，该方法敏感性强、特异性好，最低检出量分别为SVA 104copies/μL、FMDV 103copies/μL。 该方法可快速检测两种水泡病病原，提高疫病防控效率。

6 疫苗研究

目前，国内外还没有商品化的疫苗用于防控SVA，首例疫苗制备方法的报道出自中国农业科学院兰州兽医研究所。Yang等[36]将2017年分离的一株临床毒株SVV CH-FJ-2017作为疫苗毒株，制备了油包水剂型的灭活疫苗，该疫苗安全性好，可产生1:90～1:360滴度的中和抗体，可抵御109TCID50/mL的病毒攻击。该毒株P1蛋白质区域与世界各地流行毒株的相同区域具有高度相似性，暗示对其他不同SVA毒株具有潜在的保护能力。后续的抗原匹配性试验以及临床效果评价仍在研究之中。

Strauss等[37]在研究SVA原壳体时发现，SVV和FMDV有很多相似之处，但它们对酸性环境的反应是不同的。FMDV的原衣壳比相应的成熟病毒粒子更稳定，已有许多FMDV病毒样颗粒 （Virus-like particles，VLPs）稳定性方面的研究，证明不同血清型的VLP疫苗稳定性可以通过改变原壳体的残基来提高。SVV的原衣壳不如包含RNA的完整衣壳稳定，如果可以在提高SVV原壳体的稳定性方面做与FMDV VLPs类似的研究，将有利于SVA VLPs的开发。

7 防控建议

7.1 做好SVA日常监测 虽然SVA感染引起猪体产生比较温和的、自限性的水泡性病变，但该病易与FMD混淆。FMDV是危害养猪业的重要传染病原，世界动物卫生组织将口蹄疫列为动物A类烈性传染病，严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，因此，做好SVA的日常监测很有必要。再者，SVA的致病机理尚不明确，做好日常监测可使我们进一步了解SVA。另外，小RNA病毒在RNA病毒中具有最高的核苷酸替换率[38]，虽然目前SVA的进化潜力尚未得到详细研究，但监控SVA有助于实时了解该病毒的进化趋势与致病力，便于防控。目前可通过病毒分离、中和试验、ELISA和PCR等多种方法鉴定SVA。

7.2 开展安全、高效的疫苗研究 疫苗免疫是防控传染病最重要的手段之一。SVA是近年来被证实有致病力的新病毒，目前尚无商品化的疫苗，但已有灭活疫苗研究的相关报道[36]和授权的发明专利（http://www2.soopat.com/Patent/201810003888）。 有研究发现[37]，自然形成的SVA原衣壳和完整的病毒粒子具有相同的抗原性。因此，进一步研究SVA病毒结构，人工制备具有良好抗原性又不具病毒遗传物质的安全、有效的VLP疫苗具有很好的市场前景。

7.3 做好生物安全措施 猪场疫病防控的关键在于建立健全生物安全体系，执行生物安全措施。养猪生产需要执行科学的管理理念，即“预防为主，治疗为辅”。目前，SVA的传播途径尚不明确，已知在农场中的牛、鼠、苍蝇等的血液样本中可检测到抗SVA的中和抗体[2]，因此，建议养猪场规范饲养管理，严格执行消毒制度并消毒到位，制定适合需求的免疫程序，做好引种隔离和病死猪无害化处理，实现安全养猪。