‘新郁’与‘无核白鸡心’葡萄杂交遗传研究

王勇，李玉玲，苏来曼·艾则孜，孙锋，伍国红，骆强伟*

（新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200）

葡萄是种植广泛的重要果树之一。目前，全世界保存的葡萄资源约5000～15 000个品种[1]。这些品种主要通过杂交、实生选种、芽变、诱变等方法获得[2]。杂交育种是葡萄育种的重要途径，这种方式是在人工控制下，通过两个不同基因型品种的配子结合而获得新品种[3]。开展葡萄杂交遗传情况研究，从微观角度开展遗传分析，有助于更好地指导葡萄杂交组合选配，把握育种方向，提高育种效率。

SSR标记（Simple Sequence Repeats Maker）是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。这些简单重复序列均匀、随机，广泛地分布于真核生物的基因组上，具有数量丰富、多态性、高信息量、多等位基因、共显性等特点，被广泛用于遗传图谱的构建[4]、目标基因的标定[5]、指纹图的绘制[6]等研究中。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2016年3月至2018年12月在新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所完成。

1.2 试验材料

新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所育种材料资源圃7年生欧亚种的‘新郁’葡萄和‘无核白鸡心’葡萄及‘新郁（♀）×无核白鸡心（♂）’5年生杂交群体62株杂交单株，详见表1。

1.3 试验方法

表1 试验材料Table 1 Test materials

表2 特异性引物序列Table 2 Specific primer sequences

1.3.1 引物序列（表2）

1.3.2 样品基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法[7]提取葡萄叶片的基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，检测提取的基因组DNA的片段长度、浓度和纯度；通过分光光度计测定并计算DNA溶液的OD260/OD280、OD260/OD230值，若前者值在1.60～1.90，后者值＞2.0可用于PCR扩增。

1.3.3 PCR反应体系及反应程序

使用PCR反应体系为：PCR MiX混合液（ng/μL）10 μL，SSR双引物混合液（ng/μL）0.8 μL，模板（20 ng/μL）2.0 μL，ddH2O 7.2 μL，总反应体系为20 μL，PTC-100型PCR仪上进行反应。

扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，45～65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后一个循环72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。在操作中根据各引物差异进行体系优化。

1.3.4 PCR产物的电泳分离

（3）上海“快乐30分”。上海目前93%的公办小学已提供晚托服务，开设了“快乐30分”综合活动和看护服务两项内容。长宁区已实现晚托服务公民办小学全覆盖；嘉定区则把为学生积淀人文素养、强健体魄和培育特长相融合，99.29%的家长对此表示满意，30%的孩子已经由原先学费高昂的培训学校“回流”到学校。

采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。制胶加入ddH2O 40 mL，10×TBE 4 mL，40%Acr-Bis 8 mL，TENMED 40 μL，10%APS 400 μL，在电磁搅拌器上搅拌均匀后，摇匀后迅速倒入凝胶槽中，若有气泡，将气泡赶到边上，迅速装好梳子。待凝胶完全凝固后，将凝胶槽安放于电泳槽中，加入足够量的0.5×TBE于电泳槽中，轻轻拔下梳子，使电泳槽中缓冲液覆盖凝胶。

准备DNA样品液：在点样板各小坑中，加PCR产物约5 μL，均匀点样。每排第一个点样孔点一个PCR Marker作为分子量标记，接好电泳仪的正负极，样品池应连接负极，打开电源进行电泳。约3 h，指示剂迁移到一定距离时，结束电泳。置凝胶于LED发光箱下，观察分离的DNA条带，照相。

1.3.5 PCR产物的电泳分离

在电脑上对凝胶电泳图片进行分析，每张图片上，第一个泳道是分子量标记PCR Marker，第二个是母本，第三个是父本。通过Marker找到目的条带所处的大致位置，进而找到父本泳道的特异条带，然后与后面的各株对应的泳道进行比较，观察那些泳道出现与目的带在一条线上的条带，记下这些单株。

表3 ‘新郁’与‘无核白鸡心’之间6对多态性特异引物的多态性与父本特异性Table 3 Polymorphism and paternity specificity of six pairs of polymorphic specific primers between 'Xinyu' and 'Centennial Seedless'

表4 引物Vchr4a对‘新郁’与‘无核白鸡心’杂交群体遗传多态性与特异性检测情况Table 4 Detection of genetic polymorphism and specificity of 'Xinyu' and 'Centennial Seedless' hybrids by primer Vchr4a

2 试验结果与分析

2.1 2对SSR标记引物对‘新郁’与‘无核白鸡心’葡萄的扩增结果

利用葡萄SSR标记引物Vchr4a和Vchr15a分别对‘新郁’与‘无核白鸡心’进行了PCR扩增和电泳检测，分析结果见表3。引物Vchr4a在‘新郁’与‘无核白鸡心’之间扩增出了6条多态性条带，其中4条是在‘新郁’上扩增的，2条是在‘无核白鸡心’上扩增的，且条带长度在100～200 bp，根据条带大小顺序编号为m1、m2、m3、m4、m5、m6。m2和m4是‘无核白鸡心’所具有，视为特异条带。引物Vchr15a在‘新郁’与‘无核白鸡心’之间扩增出了5条多态性条带，其中3条是在‘新郁’上扩增的，2条是在‘无核白鸡心’上扩增的，且条带长度在100～200 bp，根据条带大小顺序编号为n1、n2、n3、n4、n5。n1和n3是‘无核白鸡心’所具有，视为特异条带。

2.2 SSR特异引物Vchr4a对‘新郁×无核白鸡心’杂交群体的扩增

利用葡萄SSR标记引物Vchr4a对62株‘新郁×无核白鸡心’杂交组合进行PCR扩增和电泳检测，结果见表4和图1。引物Vchr4a在亲本‘新郁’与‘无核白鸡心’之间扩增的6条多态性条带，在‘新郁×无核白鸡心’F1代的遗传上表现为7种类型。m1+m3+m4+m5+m6型最多为29个，占46.78%；其次为m3+m5型为18个，占29.03%。母本‘新郁’所具有的4条条带分布于整个群体。父本‘无核白鸡心’具有的2个条带与母本‘新郁’所具有的4个条带组合表现为5种类，共分布于41个单株中。这说明引物Vchr4a所标记的基因，就‘新郁’而言，遗传给后代的能力强。该标记至少能确定群体中41个单株是‘无核白鸡心’的杂种。

图1 引物Vchr4a对‘新郁×无核白鸡心’杂交组合的扩增结果Figure 1 Amplification results of primer Vchr4a in 'Xinyu×Centennial Seedless' hybrid combinations

2.3 SSR特异引物Vchr15a对‘新郁×无核白鸡心’杂交群体的扩增

利用葡萄SSR标记引物Vchr15a对62株‘新郁×无核白鸡心’杂交组合进行PCR扩增和电泳检测，结果见表5和图2。引物Vchr15a在亲本‘新郁’与‘无核白鸡心’之间扩增的5条多态性条带，在‘新郁×无核白鸡心’F1代的遗传上表现为4种类型。n2+n4型最多为48个，占77.42%，其次为n3+n5型为12个，占19.35%。母本‘新郁’所具有的3个条带分布于整个群体。父本‘无核白鸡心’具有的2个条带与母本‘新郁’具有4个条带组合表现为3种类，共分布于14个单株中。这说明引物Vchr15a所标记的基因，就‘新郁’而言，遗传给后代的能力也很强。该标记至少能确定群体中14个单株是‘无核白鸡心’的杂种。

图2 引物Vchr15a对‘新郁×无核白鸡心’杂交组合的扩增结果Figure 2 Amplification results of primer Vchr15a in 'Xinyu×Centennial Seedless' hybrid combinations

3 讨论与结论

分子标记技术是一种以DNA多态性为基础，通过检测DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生多态性的技术。该技术不受环境因素及发育阶段的影响，具有快速、简单、准确、可靠、稳定、经济等特点，特别是SSR标记技术因具有较好的稳定性和多态性，在葡萄的分子标记辅助育种中应用的比较广泛。Thomas等[8]、Bowers等[9-10]、Sefc等[11]相继开发了9个适合葡萄品种鉴定的SSR引物：VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD32、VVMD28、VVMD27、VVMD25、VrZAG79、VrZAG62。在国际上，法国、德国、意大利等利用该9对引物建立了葡萄品种分子数据库（www.vivc.de），在线为葡萄科研工作者提供查询服务，为国际上葡萄品种的鉴定与交换奠定了基础。但遗憾的是，该数据库中不包含中国育成品种。目前，在葡萄基因组上已经定位了753个SSR标记[12]，这为葡萄杂交真伪性鉴别提供了理论依据。李贝贝等[13]利用SSR分子标记技术对314份葡萄品种进行了DNA指纹数据库构建和遗传多样性分析。樊秀彩等[14]以山葡萄、河岸葡萄以及239株二者的杂交后代为材料，利用SSR引物作为杂种鉴定的标记，进行了有效地葡萄属种间杂种真伪性鉴定。宪立杰等[15]利用SSR标记技术对45个葡萄品种进行了遗传多样性分析，并建立了葡萄品种SSR基因型指纹库。杜晶晶[16]应用9对SSR引物构建了80份葡萄种质的有效分子身份证。郭春苗等[17]利用4条SSR标记引物构建了新疆44个适宜制干葡萄品种DNA指纹图谱。在此基础上，本文从中选择2对标记开展‘新郁’与‘无核白鸡心’基因测定，研究定位基因遗传情况，进一步完善分子标记辅助育种技术，为自育葡萄杂交真伪性鉴定和指纹图谱构建奠定基础。

本文认为，两个SSR引物所标记的母本‘新郁’的遗传物质能够在杂交群体中普遍遗传，父本‘无核白鸡心’的遗传物质在杂交群体中表现为部分遗传。SSR标记引物Vchr4a与Vchr15a可以用来鉴定该组合的杂交真伪性，Vchr4a所标记的基因比Vchr15a标记的遗传能力强。但葡萄是具有高度杂合基因的多年生植物，单靠1条或2对引物不能完成群体的杂交真伪性鉴定。