肉鸭浆膜炎的诊断和治疗

2019-09-26 03:41周德刚左春生
信阳农林学院学报 2019年3期
关键词:浆膜鸭群氏杆菌

周德刚,左春生

(1.洛阳惠中兽药有限公司,河南 洛阳 471000;2. 信阳农林学院 牧医工程学院,河南 信阳 464001)

鸭传染性浆膜炎(infectious serositis of duck)又称鸭疫里氏杆菌病,由鸭疫里氏杆菌(R.anatipestifer)引起的鸭、鹅、火鸡等禽类的急性或慢性败血性传染病,在世界范围内广泛存在,目前已成为严重危害养鸭业生产的主要疾病,该病以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为主要病变特征,病死率高达90%,给养鸭业造成了巨大的经济损失[1-4]。该病菌通常存在于患病动物的全身各组织、分泌物和排泄物中,不良因素刺激、抵抗力下降、病菌侵入机体等引起发病,天气气候突变极易暴发,给养殖场造成很大的经济损失。信阳地区水网密布,适合鸭的养殖,鸭的养殖量位居河南省首位,但鸭浆膜炎较常发生,给养殖户带来较大经济损失。为更好地防治该病,作者将收集到的病死鸭样品进行细菌分离、鉴定与药敏试验,以期为浆膜炎的防控提供参考。

1 发病情况、病料收集

1.1 发病情况

信阳市某肉鸭场,存栏3000只25日龄麻鸭。2019年3月18日发病,病鸭出现精神萎顿、厌食少食、腹泻排绿色粪便、运动失调、角弓反张等症状,到3月23日已经死亡200多只。

1.2 样品采集

取病死鸭全血、肺脏、肝脏、脾脏等部位,2~8℃冷藏被检;用无菌棉签取病死鸭口腔、泄殖腔双拭子样品,放装有PBS的离心管中,冷冻保存备检。

2 检测方法

2.1 病料剖检

将病死鸭仰卧于解剖台上,从胸骨后缘两侧沿肋骨中部剪开,暴露腹腔;再小心剪开头部皮肤,露出脑膜,观察并记录其病理变化。

2.2 细菌分离、镜检

用无菌刀剪取新鲜死鸭病变明显部位,划线接种于麦康凯琼脂平板、巧克力平板上,在37℃温箱中培养24h以上,观察菌落生长情况,并取生长菌落纯培养;取病死鸭组织器官、平板上培养物涂片,革兰氏染色后,显微镜下观察细菌形态。

2.3 生化鉴定

将纯培养物接种于含有5%胎牛血清的LB液体培养基中,随后取少量培养液加入生化鉴定管中,在温箱中37℃培养24h后,观察并记录结果。

2.4 PCR鉴定及测序

用禽流感通用型PCR检测试剂盒检测双拭子样品,检测鸭群是否有禽流感病毒感染。

采用DNA提取试剂盒提取采集组织及分离培养菌的DNA,参照文献[5]建立的鸭疫里氏杆菌PCR检测方法操作:设计针对鸭疫里氏杆菌的16SrRNA 特异性引物序列,上游引F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATG;下游引物 R:TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC,预计扩增目的1481 bp;反应条件:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s,52 ℃退火 40 s,72 ℃延伸 1 min,30 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。

对采集的样品及培养物进行PCR扩增,电泳检测,提取阳性质粒送生物公司测序,并将测序结果同已发表的序列进行同源性比较。

2.5 分离菌株的药敏试验

采用纸片法[6-7]测定强力霉素、头孢曲松、新霉素、阿米卡星、阿莫西林、大观霉素、恩诺沙星、林可霉素、氨苄西林、氟苯尼考等10种药物对分离细菌的敏感性,通过测定抑菌圈的直径(Φ)判定药物对鸭疫里氏杆菌的敏感性。

2.6 检测用仪器及试剂

所用仪器:光学显微镜(上海无陌光学仪器有限公司);台式高速冷冻离心机(湖南湘仪);荧光PCR仪、核酸提取仪(杭州朗基科学仪器有限公司 );PCR仪(美国伯乐公司);电泳仪、凝胶成像系统(北京六一生物科技有限公司);数显恒温水浴锅;生化培养箱。

主要检测试剂:禽流感病毒通用型单重荧光PCR检测试剂盒(批号:20180906),购自北京亿森宝生物技术有限公司;普通Tap DNA聚合酶、10×缓冲液、dNTP、DNA Marker、琼脂糖等购自大连宝生物工程有限公司;DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司;引物由生工生物工程(上海)有限公司合成;LB培养基、麦康凯平板、巧克力琼脂平板、胎牛血清、革兰氏染色试剂、细菌生化鉴定管、药敏片(部分自制)等购自郑州宝赛科贸有限公司。

3 检测结果

3.1 观察症状及病理变化情况

从图1、图2看到,病鸭角弓反张,倦怠、缩颈、眼鼻有分泌物,排淡绿色粪便;解剖后看到全身浆膜面有纤维性渗出物,典型纤维性心包炎、肝周炎(见图3)。

图1病鸭角弓反张 图2拉绿色稀粪

图3病死鸭肝脏、心脏上包一层纤维素膜 图4鸭疫里氏杆菌染色图片

3.2 细菌分离及镜检结果

分离菌在麦康凯平板上不生长,在巧克力琼脂平板培养后,形成直径1~2mm菌落,菌落表面光滑、圆形、半透明状,未出现溶血现象;将分离物和培养菌落直接涂片,革兰氏染色后,显微镜下观察,可见两端钝圆的短杆状的球杆菌,革兰氏阴性(见图4),结合生化鉴定试验结果初步判定为鸭疫里氏杆菌。

3.3 分离菌生化鉴定结果

从表1 可以看出,本试验分离的菌株氧化酶和触酶阳性,不发酵葡萄糖、蔗糖,吲哚试验、VP和甲基红试验、脲酶阴性,不产生硫化氢。

表1 分离菌株生化鉴定结果

3.4 分离菌株的PCR鉴定结果

病料提取DNA后,禽流感病毒荧光PCR扩增为阴性,该鸭群无禽流感病毒感染(见图5)。将分离菌进行普通PCR扩增后,1%琼脂糖凝胶电泳,在1400bp左右处出现明显条带(见图6),与期望目的片段一致,将测序结果与已发表的鸭疫里氏杆菌基因序列对比,同源性达99.2%以上,确定本试验分离菌为鸭疫里氏杆菌。

图5样品禽流感病毒扩增结果
M:DNAMarker(DL2000);1:样品,P:阳性对照,N:阴性对照图6病料PCR扩增图

3.5 药敏筛选结果

对分离细菌株药敏试验结果见表2,大部分药物对此次试验分离株是高敏的,阿莫西林、林可霉素中敏,只有氨苄西林耐药。

表2 巴氏杆菌药敏试验情况

注:抑菌圈直径大于15mm者为高敏药物;直径为10~15mm者为中敏药物;直径10mm以下者为耐药。

4 分析与讨论

鸭浆膜炎是引起肉鸭死亡的主要疾病之一,主要危害2月龄以内的雏鸭,但以2~3周龄最易感,严重者发病率90%以上,死亡率5%~75%不等,给鸭养殖户带来较大经济损失。对鸭群来说,在气温骤变或有应激因素存在时,较易发生传染性疾病,而且以传染性强、发病率高为特征,多为混合感染,死亡率较高,给诊断和治疗带来难度。本研究采用细菌培养、镜检、生化及PCR鉴定等手段在信阳地区发病鸭群中分离到鸭疫里氏杆菌;为防治该病,又采用药敏试验筛选出氟苯尼考、头孢曲松等高敏药物,为防治该病提供指导。该养殖户采用清瘟败毒散配合氟苯尼考拌料治疗3天后,未再出现鸭浆膜炎病例,全群病情得到控制。

鸭浆膜炎是常见、多发的禽类传染病,病原菌可经患病动物的排泄物、分泌物等污染的饲料、饮水、用具和内外环境传播,也可经消化道传给健康动物,飞沫、咳嗽排出的带病菌也可传播本病。为防控该病,建议鸭场采取综合性防控措施:一是给予鸭群特异性抵抗力,选择针对本场流行毒株的鸭浆膜炎疫苗在7日龄、21日龄免疫鸭群;二是加强饲养管理,改善鸭群生长环境,给予营养合理的饲料,定期在饲料中添加保健性药物和抗应激药物,提高抵抗力;三是要做好鸭舍的清洁卫生,定期清粪、消毒鸭舍,减少各种细菌传播因素;四是为了降低药物的耐药性,可以采用细菌分离和药敏试验筛选防治药物。

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