铜绿微囊藻增殖与产毒过程中的氮磷限制与主控因子研究

任梦甜，陈 荣，雷 振，薛 涛，王晓江

(西安建筑科技大学环境与市政工程学院，陕西 西安 710055)

以上研究多集中于单一形态的氮在磷充足的情况下对藻细胞增殖和产毒的影响，而对不同形态的氮在不同氮磷浓度下对藻类生长和产毒的影响研究较少。本研究通过设计正交试验，针对不同形态的氮在不同氮磷浓度下，氮、磷及其形态对微囊藻生长和产毒的影响进行研究，以期揭示氮磷源对微囊藻生长和产毒的影响机理，确定氮磷在藻类增殖和产毒素过程中的主控因子。

1 材料与方法

1.1 试验藻种

试验采用藻种为铜绿微囊藻，购于中国科学院水生生物研究所的淡水藻种库。开始试验之前，将铜绿微囊藻在对数期反复接种进行扩大培养。

1.2 培养条件的设定

1.3 预培养、饥饿处理及接种

取适量的藻种，将其接种到新配置的BG-11培养基中，培养7 d得到对数期藻种。将此对数期的藻种进行去除营养物质处理，6 000 r/min离心10 min，倒掉上清液后用15 mg/L的NaHCO3洗涤3次后保留离心得到的藻细胞，后接种至不含氮、磷培养基中培养7 d。饥饿处理后按前述方法再次去除营养物质，接入配置的不同氮磷浓度梯度的培养基中，初始接种浓度为2×105个/mL，pH=7.1。培养周期一般在12～18 d。试验过程中每天摇晃培养液3次，期间改变各组别培养位置，以尽量减少光照对试验结果的影响。为确保试验结果的准确性，本研究中所有样品均设2个平行样。

1.4 指标测定

藻密度的测定采用细胞计数分析仪(Cellometer Auto T4，达科为，中国)，该细胞计数仪相比人工计数法能根据细胞的形态辨别细胞是否死亡，可以较准确地计数。每次测定取样量为1 mL，从接种第2天开始测定，每隔1 d测定一次。

藻毒素(细胞内)的测定采用高效液相色谱(LC-2000，日立，日本)，分离柱尺寸为250 mm×4.6mm(SB-C18，安捷伦，USA)。流动相为甲醇，磷酸盐缓冲溶液体积比为0.57∶0.43，流速为1 mL/min，进样量为40 μL。从培养第4天开始每隔3 d测定一次MC-LR产量。每次取样量控制在10～25 mL，前期取样量多，后期逐渐减少。样品的制备参考Long[21]的制备方法。

比增长率μ是衡量藻类增殖的另一重要参数，其计算公式为

μ=ln(Xt/Xt-T)/T

(1)

式中：Xt为第t天的藻密度；Xt-T为第t-T天的藻密度；T为时间间隔。当连续2 dμ值小于5%时，藻细胞增殖停止，试验结束。

文中所有试验数据均采用Excel 2007分析，图均用Origin 9.0绘制。数据统计学分析采用SPSS19.0，P值表明各组数据之间存在显著性差异，P值越小表示各组数据之间的显著性差异越大。

2 结果与讨论

2.1 藻细胞密度

图1 不同氮磷条件下铜绿微囊藻的最大藻细胞密度值

2.2 对数期的比增长率

图2 不同氮磷条件下铜绿微囊藻在对数期的比增长率

2.3 藻毒素合成

根据标准样品检测结果，铜绿微囊藻在生长过程中共产生3种MC异构体：MC-RR、MC-YR、MC-LR。在本试验的氮磷条件下，各试验组在试验过程中合成的MC-RR含量非常少，几乎检测不到，MC-YR在各组中虽能检测到，但只占藻毒素总含量的3%～10%。因此，本试验的氮磷条件下以MC-LR为主导性藻毒素。

图3 不同培养条件下各培养组的最大MC-LR浓度

2.4 藻细胞密度与MC-LR的相关性分析

表1 藻细胞密度与MC-LR的相关系数

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 结 论