睡眠剥夺对大鼠血脑屏障的影响

李丹丹，马芮，黄敏莹，赵弘轶，黄勇华

1.中国人民解放军总医院第七医学中心神经内科，北京市100700；2.山西医科大学第二临床医学院，山西太原市030001；3.安徽医科大学，安徽合肥市230032；4.南方医科大学第二临床医学院，广东广州市510515

血脑屏障是分子和细胞进出中枢神经系统的主要调节因子[1]，负责选择性透过血浆各种溶质，维持脑稳态等[2-3]，但易受激素、神经递质等影响[4]。蛛网膜下腔出血、阿尔茨海默病、创伤性脑病等多种疾病都存在不同程度血脑屏障障碍，并伴有神经元细胞损伤和凋亡增加[5-7]。通常观察Evens Blue(EB)脑区渗漏情况评估血脑屏障变化[8-9]。

睡眠有助于能量与精力恢复[10-11]。睡眠时间不足是常见的社会现象。睡眠时间减少与心血管病、糖尿病和抑郁等有关[12-13]，还会引起代谢紊乱，损害神经行为功能[14]。血脑屏障与睡眠之间的关系开始成为神经科研究热点[15]。Pan等[16]认为，睡眠可能是调节血脑屏障功能的重要因素，列出两者之间可能存在相互作用的5个方面。Sharma等[17]也观察到，睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)后，EB染液会渗漏于多个脑区。

本研究针对SD对成年雄性大鼠血脑屏障的影响及睡眠剥夺恢复(sleep deprivation and recovery,SDR)的作用进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠90只，体质量260～280 g，清洁级：斯贝福生物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)2016-0002。

鼠抗β-tubulin抗体(GB13017-2)、HRP标记山羊抗小鼠IgG(GB23301)：谷歌生物科技有限公司。抗NeuN抗体(ab177487)、抗Bax抗体(ab32503)、抗Caspase-3 p12抗体(ab179517)：ABCAM公司。CD31(PECAM-1,sc-71873)、 Occludin(H-279,SC-5562)：SANTA CRUZ公司。紧密连接蛋白zonula occludens-1(ZO-1)多克隆抗体(21773-1-AP)：PROTEINTECH公司。兔抗Claudin-5抗体(CLDN5,PB0123)：BOSTER公司。BCL-2多克隆抗体(A11025)、TP53多克隆抗体(A5761)：ABCLONAL公司。HRP标记山羊抗兔IgG(M21002)：ABMART公司。Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L,A0423)、Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG(H+L,A0460)、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(C1089)：碧云天生物技术有限公司。

大鼠的饲养、造模、取材等操作均严格遵守动物福利与伦理准则。

1.2 模型建立

大鼠称重，按体质量从轻到重标号；采用SPSS软件将编号随机分入SD组、SDR组和K组，每组30只。SD组和SDR组大鼠放入水平台内连续5 d，期间注意观察大鼠状态，每天更换清洁水，并予充足食物。SDR组之后正常饲养2 d。K组不采取措施。

1.3 取材

造模结束后，大鼠用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉。

1.3.1 Western blotting

每组取10只断头取脑，迅速分离出大脑皮质，-70℃保存。将冻存的大脑皮质充分研磨，加入RIPA裂解液，加入PMSF(1∶500)，冰上充分裂解30 min；12 000 r/min 4℃离心15 min，留取上清液，按比例加入变性蛋白上样缓冲液，混匀，沸水煮8～10 min。加ZO-1(1∶ 500)、 Occludin(1∶ 200)、 Claudin-5(1∶1000)、Bax(1∶1000)、BCL-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、TP53(1∶3000)一抗，内参为β-tubulin(1∶2000)；二抗为HRP标记山羊抗兔IgG(1∶4000)和山羊抗小鼠 IgG(1∶4000)。BIO-RAD XRS+Software显影，Image J图像分析软件进行灰度分析。

1.3.2 EB染色

每组取10只，2%EB染液1 ml心脏灌注，10 min后以生理盐水300 ml和4%多聚甲醛300 ml灌注，留取完整大脑4%多聚甲醛浸泡备用。大脑从前额叶到小脑均匀切成10份，观察相同切面各脑区EB染液的渗出情况。

1.3.3 免疫荧光染色

每组取10只，生理盐水300 ml和4%多聚甲醛300 ml心脏灌注，取出完整大脑，置4%多聚甲醛、20%和30%蔗糖溶液梯度固定，大脑皮质冰冻切片，厚10 μm，两张切片间隔100 μm。免疫荧光染色，一抗为NeuN(1∶300)、CD31(1∶50)，二抗为Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG(1∶500)和Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG(1∶200)。DAPI细胞核染色。计数0.01 cm2内阳性细胞数。计数TUNEL阳性细胞数。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0进行统计学分析。计量资料满足方差齐性(P＞0.05)，用()表示，组间比较采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Western blotting

三组间各蛋白表达有非常高度显著性差异(P＜0.001)。P53、Caspase-3、Bax/BCL-2表达SD组最多，K组最少；ZO-1、Occludin、Claudin-5表达SD组最少，K组最多；SDR组均介于两者之间。见表1、图1。

图1 各组Western blotting条带图

2.2 EB染色

相较K组，SD组小脑、海马、尾状核、顶叶、颞叶、枕叶、扣带回等多个皮质有EB染液渗出；SDR组相应部位也有EB染液渗出，较SD组轻微；K组各层面未见EB染液渗出(图2)。

2.3 免疫荧光染色

三组间各蛋白表达有非常高度显著性差异(P＜0.001)。皮质中CD31、NeuN阳性细胞数SD组最少，K组最多；TUNEL阳性细胞SD组最多，K组最少；SDR组介于两者之间。见表2、图3～图5。

表1 各组大鼠各蛋白表达(/β-tubulin)

表2 各组免疫荧光染色阳性细胞数(n)

图2 各组大脑EB染液渗漏情况

图3 各组CD31表达(免疫荧光染色,×200)

图4 各组NeuN表达(免疫荧光染色,×200)

图5 各组TUNEL表达(免疫荧光染色,×200)

3 讨论

睡眠是一个节省能量、恢复精力的过程，是机体自我平衡与复原的重要机制，是动物维持生命所必需的稳态过程[11]。SD能影响脑内物质和能量代谢，对健康产生广泛影响，增加多种疾病发病率[18-20]。经常经历SD(如执勤的军事人员[21])影响大脑功能，表现为执行、认知能力下降(如简单运算降低[22]等)。Esposito等[23]发现，健康青年人在经历SD 24 h后，在记忆依从性、客观警惕和主观警惕等方面出现功能障碍。长时间SD能导致大鼠出现焦虑样行为[24]、认知功能障碍[25]、健康恶化甚至死亡[26]。SD提高大脑的去甲肾上腺素水平，破坏线粒体，释放细胞色素C，从而诱导神经细胞凋亡和变性[27]。也有研究在经历SD的大脑中未发现细胞凋亡和坏死[28]。SD可能导致大脑功能缺陷，不一定伴有脑组织结构变化。

本研究显示，大鼠经历SD后，大脑多部位出现不同程度EB染液渗漏，提示血脑屏障被破坏；大鼠皮质中紧密连接蛋白表达降低，血管内皮细胞受损，数目减少；经历SD后，大鼠皮质中凋亡相关抗体表达增高，神经元数量减少，凋亡增高。总体而言，SD导致大鼠血脑屏障功能障碍，通透性增加，破坏脑稳态，使脑内细胞凋亡增加，神经元数目减少。这可能是SD影响中枢神经系统功能的机制之一。

Sung[29]发现，SD 24 h后休息72 h，SD引起的高攻击性和抑郁情绪可以恢复正常。本研究在SD后予恢复睡眠48 h，发现血脑屏障破坏和细胞凋亡等情况有所改善。睡眠恢复仅能部分缓解SD的不利影响。

睡眠是必不可少的自我恢复过程。现代社会存在睡眠时间不足、睡眠质量差等问题，影响人体健康。其具体作用机制和过程仍未完全解开，还需更多研究进一步阐释。