调脾护心方对慢性心力衰竭大鼠toll样受体4及TNF-α表达的影响

付 军，祝德伟2，戴小华，杨 帆，王银燕，戚先伟

慢性心力衰竭是多种心血管疾病最终的归宿，是由高血压、冠心病、心脏瓣膜病等各种原因引起心脏负荷过重、心肌收缩力下降，导致心排血量不足引起一系列临床症状和体征的复杂综合征。相关调查显示：我国慢性心力衰竭病人发病率高达0.9%，且随着年龄不断增加，发病率逐年增高，严重威胁人类的健康和生活质量[1]。目前认为心室重构是慢性心力衰竭发生的基本机制，近年来随着对慢性心力衰竭机制的不断深入研究，炎性细胞因子在慢性心力衰竭发生发展中的作用引起学者关注。有研究发现，免疫系统介导在心力衰竭中起到重要的作用，可激发炎症因子释放炎症因子，加速心肌肥大及纤维化，促进心肌细胞凋亡，引起心室重构，从而导致心力衰竭的发生和发展[2]。本研究观察调脾护心方对慢性心力衰竭大鼠toll样受体4和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响及光镜下大鼠心肌细胞的变化情况，探讨中药调脾护心方对慢性心力衰竭大鼠炎症因子的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择体重250～300 g周龄配对的SD雄性健康大鼠40只，所有大鼠均购自安徽中医药大学动物实验中心，随机分为对照组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组和模型组，各8只。

1.2 实验药品与试剂 调脾护心方(颗粒剂)，组方：茯苓、陈皮、炙甘草、广木香、酸枣仁、炙远志、白术、蒲公英等，为安徽省中医院提供；培哚普利(施维雅制药有限公司，批准文号：H20034053，规格：每片4 mg)；B型钠尿肽(BNP)抗体(上海信裕生物工程有限公司)；toll样受体4多克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司)；大鼠toll样受体4免疫法试剂盒(R&D system 公司)，大鼠TNF-α免疫法试剂盒(R&D system 公司)。

1.3 实验设备 小动物呼吸机(北京拜安吉科技有限公司)，心电图机(上海 XDH-3B)，多导生理仪(Power Lab数据采集分析系统，澳大利亚 ADInstruments 生产)。

1.4 实验方法

1.4.1 造模方法 左冠状动脉前降支结扎法：40只SD雄性健康大鼠术前禁食8 h，之后采用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉，将大鼠头部及四肢固定于手术台上，并用牙线固定牙齿，待大鼠呼吸平稳后，行气管插管连接小动物呼吸机，调整通气量(成功标准为吸呼比1∶2，呼吸频率90次/min，潮气量14 mL/kg)，标记大鼠正常心电图。完成后，充分暴露大鼠左前胸，常规剃毛、消毒后，沿胸骨左侧第3、4肋间打开大鼠胸腔，暴露大鼠心脏，之后使用无菌齿镊轻提左心耳，暴露大鼠心脏主动脉根部，带线缝合针绕过冠状动脉(心上缘)结扎心肌组织2～3 mm，打两个死结，以缝线下心肌颜色变浅变白，同时结扎成功标准为心电图提示模型大鼠Ⅱ导联ST段明显抬高(≥0.1 mV)[3]。缝合胸壁后，术后皮下注射青霉素8×105U，呋塞米20 mg，盐酸利多卡因0.1 g预防感染及利尿，待大鼠恢复自主呼吸后撤离呼吸机。将术后存活大鼠常规喂食及水4周。第28天用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后备皮，采用多导生理仪系统测量各组大鼠左室舒张末压(LVEDP)，具体操作：大鼠消毒备皮后，头部及四肢固定于手术台上，分离右颈总动脉，将多导生理记录仪一端插入右颈总动脉，之后进一步接入左心室，另一端接入压力换能器，之后同步记录心电图、LVEDP。造模成功标准为[4]LVEDP>15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.4.2 给药方法 中药高剂量组以23.40 mg/(kg·d)标准给予调脾护心方颗粒剂灌胃，中药低剂量组以5.85 mg/(kg·d)标准给予调脾护心方颗粒剂灌胃，西药组以0.36 mg/(kg·d)标准给予培哚普利灌胃，模型组和对照组给予相同剂量生理盐水灌胃。各组均给予相应药物灌胃4周。

1.5 标本采集及检测方法

1.5.1 心电图 采用动物心电图机(型号为XD7100)于造模前后检测并记录所有大鼠心电图。

1.5.2 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测BNP、TNF-α 灌胃前于大鼠眼眶后采集血液5 mL，加入抗凝管，以3 000 r/min离心5 min，通过实验室自动生化分析方法进行检测。

1.5.3 toll样受体4蛋白检测 灌胃4周后，打开胸腔，取心室肌组织，将取出的心肌组织在抽提液中溶解，之后离心后收集上清液；将载有蛋白的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)通过转膜方法放入到缓冲液中；取出PVDF后，放入到稀释1∶1 000的一抗中，之后静置整晚后，再洗膜3次，频率为每10 min洗膜1次；稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗(羊抗鼠IgG)到工作浓度(1∶1000)，之后将膜置于二抗中，37%摇床孵育1 h；每10 min 1次，洗膜次数共5次。以β-actin为内参，检测toll样受体4蛋白表达。

1.5.4 免疫组化检测TNF-α表达 取出水合氯醛麻醉后的心室心肌组织，采用4%多聚甲醛固定，时间24 h，脱水、石蜡包埋，以磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗切片脱蜡的心室心肌组织，采用柠檬酸高压方式修复2min；PBS冲洗，经过整晚时间后在TNF-α一抗(1︰200)基础上，加二抗以37 ℃温度孵育2 h，心室心肌组织通过苏木素再次染色10 s后，光学显微镜下观察、拍照，之后通过Motic Med 6.0数码医学图像分析心室肌组织TNF-α表达。

1.5.5 心肌病理学观察 灌胃结束后，采用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉，取出心室心肌组织，之后沿左心室长轴横断面取厚度合适的数张切片(间隔为 1 mm)，厚度约4 μm，通过4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，所有标本HE染色。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 手术过程或术后感染共4只大鼠死亡，其中中药低剂量组1只，西药组1只，模型组2只。除对照组外，其他各组大鼠均出现不等程度倦卧、脱毛、精神萎靡、纳食减少、消瘦等症状；经药物治疗后，大鼠上述症状均有不同程度改善，其中中药高剂量组改善更显著；与模型组比较，中药低剂量组与西药组大鼠上述状态有所改善。

2.2 大鼠心电图比较 模型大鼠Ⅱ导联ST段明显抬高(≥0.1 mV)，提示急性心肌梗死大鼠造模成功。详见图1、图2。

图1 造模前心电图

图2 造模后心电图

2.3 各组大鼠心功能比较 与对照组比较，模型组和各给药组大鼠LVEDP均>15 mmHg，且差异有统计意义(P<0.05)，提示慢性心力衰竭模型造模成功。与对照组比较，模型组和各给药组大鼠BNP明显偏高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明通过结扎左冠状动脉前降支可建立慢性心力衰竭大鼠模型。详见表1。

组别只数LVEDP(mmHg)BNP(ng/mL)对照组 8 8.69±1.13123.58±15.41 模型组 6 17.83±1.651)730.13±23.151)西药组 7 18.57±2.451) 702.29±63.131)中药低剂量组 7 17.92±1.591) 649.13±27.831)中药高剂量组 8 16.07±0.951) 670.85±36.301)

与对照组比较，1)P<0.05

2.4 各组大鼠toll样受体4水平比较 模型组大鼠心肌toll样受体4蛋白表达明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药低剂量组、中药高剂量组、西药组心肌toll样受体4蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；中药低剂量组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图3。

组别 只数toll样受体4对照组 80.28±0.07模型组 61.31±0.071)西药组 7 0.56±0.052)中药低剂量组 7 0.81±0.082)3)中药高剂量组 8 0.58±0.062)

与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与西药组比较，3)P<0.05

1为对照组；2为模型组；3为中药低剂量组；4为中药高剂量组；5为西药组

图3各组toll样受体4蛋白相对表达量比较

2.5 各组大鼠心肌组织TNF-α水平比较 免疫组化染色后，模型组心肌细胞胞浆内可见TNF-α蛋白阳性表达，呈棕黄色，各治疗组心肌细胞胞浆内TNF-α蛋白表达减少，尤以中药高剂量组、西药组心肌细胞胞浆内明显，详见图4。模型组大鼠心肌TNF-α表达明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药低剂量组、中药高剂量组、西药组心肌TNF-α表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；中药低剂量组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

图4 各组大鼠心肌细胞胞浆内TNF-α表达情况

组别 只数 TNF-α 对照组867.96±9.01模型组 6286.49±28.791)西药组7138.73±18.012)中药低剂量组 7216.72±13.452)3)中药高剂量组 8141.73±17.702)

与对照组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05；与西药组比较，3)P<0.05

2.6 各组大鼠心肌细胞病理图像 对照组大鼠心肌细胞形态正常，心肌纤维未见增粗，未见水肿、坏死；模型组心肌纤维粗大、水肿及坏死、心肌细胞排列紊乱；中药高剂量组与西药组心肌细胞改善情况比较，无显著差异；中药低剂量组心肌纤维改善明显，心肌细胞排列紧密。详见图5。

图5 各组大鼠心肌细胞病理图像

3 讨 论

相关研究表明，各种炎性因子激活与慢性心力衰竭密切相关，它们在心力衰竭的发生发展中发挥重要作用[5]。toll样受体4蛋白是近年来发现的与心血管疾病相关的天然免疫受体，主要由内质网分泌和产生，在人体内多种细胞中广泛表达，介导天然免疫的跨膜信号传递受体[6]，toll样受体4可调节心肌细胞炎症状态，参与心肌炎、心肌梗死后、心力衰竭等心血管疾病发生[7]。有研究表明，包括冠心病在内的缺血性心脏病均存在toll样受体4分子表达上调，而这种增高与疾病严重程度及炎性介质TNF-α、白介素6(IL-6)相关[8]，且心功能越差者，toll样受体4表达越高[9]。toll样受体4可激活心肌细胞内的核因子-κB，可使核因子-κB由细胞质转移至细胞核，从而引起IL-6、TNF-α等炎症因子表达升高。炎性物质浸润，使心肌实质减少，纤维组织增多，从而导致心室重构及心力衰竭的形成[10]。

TNF-α主要由激活的巨噬细胞生成，目前越来越多研究发现TNF-α是慢性心力衰竭发生、发展中重要的影响因素，可反映慢性心力衰竭的严重程度。TNF-α对心肌具有负性肌力作用，可加速心肌细胞凋亡，促进心室重塑，且TNF-α水平越高，慢性心力衰竭严重程度和病人病死率越高[11]。TNF-α通过抑制肌浆网Ca2+泵，参与左心室重塑和心肌纤维化过程从而使其功能丧失[12]；通过激活多个细胞凋亡途径，诱导心室重塑，促发心肌细胞凋亡，介导慢性心力衰竭的发生[13]；刺激诱导型一氧化氮合酶生成一氧化氮，损伤心肌细胞，抑制心肌收缩力，从而导致心力衰竭[14]。

调脾护心方由戴小华主任根据归脾汤及酸枣仁汤化裁而成，主要由茯苓、陈皮、白术、炙甘草、广木香、酸枣仁、炙远志、蒲公英等药物组成，具有健脾益气、养心安神之功效。临床治疗慢性心力衰竭过程中，发现其能减轻临床症状，改善病人心功能及预后[15]。前期实验研究发现，调脾护心方可明显降低血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性，并可相应降低BNP、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、C反应蛋白(CRP)等[16]。本研究结果显示，调脾护心方能改善大鼠慢性心力衰竭心功能，减轻临床症状，其机制与抑制慢性心力衰竭炎症状态有关，抗炎作用与培哚普利相当，同时为调脾护心法改善慢性心力衰竭炎症状态提供有力的实验依据。