一种pH响应型光敏剂的活性和细胞毒性

鄢树枫，黄晓晨，邢建宏，刘希华，张君诚

（1.三明学院 药用植物开发利用福建省高校工程研究中心，福建 三明365004；2.三明学院 资源与化工学院，福建 三明 365004；3.中国科学院福建物质结构研究所，福建 福州 350002）

当前，癌症仍然是广泛威胁人类健康的重大疾病之一，每年都造成全世界大量的患者死亡。 针对癌症治疗，外科手术治疗、放射疗法和化学疗法是目前临床应用中传统的三种方式。 光动力疗法（Photodynamic Therapy，PDT）是一种新型的肿瘤治疗方法，主要是利用光敏剂在有氧条件下被特殊波长的光激发后，产生具有细胞毒性的单线态氧。 相比于传统的癌症治疗方式，光动力疗法是一种微创、几乎没有副作用的新疗法。 目前，光动力疗法已经被证实可作为高效的抗肿瘤治疗手段，在科研和临床上都有较广泛的探索和应用[1-2]。 光动力疗法的疗效主要依赖于光敏剂，不同的光敏剂具有的激发波长、单态氧产率和细胞毒性等各不相同。 迄今为止，只有少数几种光敏剂得到官方批准上市应用[3-5]。 本文在前期化学合成ZnPc(TAP)4光敏剂的基础上[6]，进一步研究ZnPc(TAP)4光敏剂的光化学性质、单线态氧产量以及对肿瘤细胞和正常细胞的选择毒性，以期为光动力抗肿瘤治疗提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

实验相关试剂主要购买于阿尔法化工有限公司、西格玛奥德里公司和百灵威公司等。 人乳腺癌MCF-7 细胞和正常成纤维细胞HELF 由中国科学院福建物质结构研究所提供。DCFH-DA 单线态氧探针、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）、胎牛血清、DMEM 细胞培养液等细胞相关试剂和耗材购买于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ZnPc(TAP)4光敏剂的pH 灵敏性分析

ZnPc(TAP)4光敏剂中带有12 个二甲氨甲基基团，对于溶液的pH 值较敏感。 根据磷酸盐缓冲液配方表，配置不同pH 的磷酸盐缓冲液，将ZnPc(TAP)4光敏剂溶解在相应的pH 缓冲液里，再分别用Synergy 4 TM 混合式多功能读板机采集各个孔的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱， 其中荧光检测选择610 nm 波长激发，检测ZnPc(TAP)4光敏剂在635～900 nm 波段的荧光图谱。 用软件绘制不同pH条件下的紫外吸收和荧光图谱。

磷酸盐缓冲液配方见表1。母液的配制：0.2 mol/L Na2HPO4： 称取 71.6 g Na2HPO4-12H2O， 溶 于 1 000 mL 水 ；0.2 mol/L NaH2PO4： 称 取 31.2 g NaH2PO4-2H2O，溶于 1 000 mL 水。

表1 磷酸盐缓冲液配方表

1.2.2 不同pH 条件下ZnPc(TAP)4光敏剂的单线态氧产量

为测定ZnPc(TAP)4 光敏剂的单线态氧产量情况，选择2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）为单线态氧检测探针。 体系中有单线态氧产生时，DCFH-DA 可转变为 DCF（2，7-二氯荧光素），DCF 经400 nm 波长光激发，在528 nm 波长处有特征荧光产生。 因而，检测528 nm 波长特征荧光的强度可推算体系单线态氧产量。设定不同pH 条件下的光照组和空白对照组，体系中加入过量的DCFH-DA探针。 不同pH 条件的光照组每隔30 s 光照一次， 并且在光照后立即检测于酶标仪中检测荧光值。空白对照组则只孵育DCFH-DA 探针，不加入ZnPc(TAP)4光敏剂。 连续检测3 min 后，汇集数据，用软件绘制不同pH 条件下ZnPc(TAP)4光敏剂的单线态氧产量曲线。

1.2.3 细胞的计数与观察

取冻存于液氮中的人乳腺癌MCF-7 细胞和正常成纤维细胞HELF，复苏后分别传代培养，约2～3 代后的细胞在显微镜不同倍数下观察细胞状态。 贴壁细胞应铺满80%以上T-25 细胞培养瓶底部，可保证实验所需细胞数目。观察细胞状态良好时进行细胞消化传代。细胞传代：使用一次性无菌吸管吸去培养瓶内原有的细胞培养液，用无血清培养基清洗细胞表面1～2 次，加入1 mL 预热的胰蛋白酶溶液，37℃培养箱中静置约1 分钟。用一次性无菌吸管吸去细胞培养瓶内的胰蛋白酶溶液，加入10 mL 新鲜、37℃预热的细胞培养基，使用5 mL 移液枪吹打均匀细胞，尽可能将T-25 细胞培养瓶底部细胞全部吹打下来。 吸取部分细胞培养液于离心管中用于细胞计数，另取5 mL 新鲜、37℃温浴的细胞培养液于T-25 细胞培养瓶，均匀后分别于37℃、CO2培养箱中静置培养。

1.2.4 肿瘤细胞和正常细胞对ZnPc(TAP)4 光敏剂的药物摄取分析

按上述方法，在生物显微镜低倍镜观察细胞状态。根据细胞计数结果，加入适量新鲜、37 ℃预热的细胞培养基稀释细胞悬液至所需细胞实验浓度（50 000 个/ mL），吹打均匀后将细胞均匀转移至96 孔细胞培养板中，每孔200 μL 细胞悬液至终浓度为10 000 个细胞/孔，将细胞置于37℃、CO2培养箱培养过夜。设置人乳腺癌MCF-7 细胞和正常成纤维细胞HELF 的摄取实验组，每组设置4 个复孔以减小实验误差。 给予细胞赋予相同的药物浓度（2 μmol/L），在不同的时间点（0、6、12 和 24 h）检测ZnPc(TAP)4光敏剂的药物摄取量。 具体实验步骤如下：到达检测时间点后，将孔中培养基弃去，用无菌PBS 或无血清细胞培养基洗涤3 次，加入200 μL 裂解液（主要成分为0.1 M NaOH / l% SDS）裂解1 h，使体系形成均一溶液。 在酶标仪中测定细胞提取液的荧光信号，测定各实验孔细胞的总蛋白量。 取实验孔裂解液 20 μL 至 96 孔透明板，加入 200 μL BCA 工作液，室温静置 2 h，检测 562 nm处紫外/可见吸收值。 根据牛血清白蛋白标准曲线，计算实验孔细胞的总蛋白量。 用每毫克蛋白含有多少毫克的ZnPc(TAP)4光敏剂来表示细胞对药物的摄取。1.2.5 ZnPc(TAP)4光敏剂的正常细胞和肿瘤细胞毒性分析

按前述方法，用生物显微镜低倍镜观察乳腺癌MCF-7 细胞和正常HELF 细胞状态。 根据细胞计数结果，分别加入适量新鲜、37 ℃温浴的细胞培养液稀释细胞悬液至所需实验细胞浓度（50 000 个/mL），吹打混匀后于细胞 96 孔板铺板细胞，每孔加入 200 μL 细胞悬液（10 000 个/孔），于 37 ℃、CO2培养箱静置培养过夜。 配置不同浓度的ZnPc(TAP)4光敏剂溶液备用。 根据实验方案，设置不同浓度的实验组（0.5， 1， 2， 4， 8 μmol/L）。 洗去培养基，加入含有不同浓度 ZnPc(TAP)4光敏剂的培养基，药物孵育2 h。 光敏剂孵育后，吸去细胞96 孔板培养孔内原有的药物培养液，加入200 μL 新鲜、37 ℃温浴的细胞培养液清洗1 次，再 加入200 μL 新鲜、37 ℃温浴的细胞培养液。 混匀后，使用680 nm、100 mW 光源对细胞培养板进行均匀光照1 min（光剂量2.5 J/cm2）。光照后将细胞培养板放置37 ℃、CO2培养箱静置培养过夜。 24 h 后，利用MTT 法检测细胞存活率。 MTT 全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料，MTT 比色法可以检测细胞存活率。 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以使外源性MTT 变成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，通常已死亡的细胞不存在这种现象。 此后利用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞甲瓒，用酶标仪在490 nm 波长处测定其光吸收值，计算出细胞的存活率、绘制细胞存活率曲线图。

2 实验结果

2.1 ZnPc(TAP)4光敏剂的pH灵敏性

酞菁类光敏剂在生物应用过程中，药物的自发聚集情况是不可忽视的一方面。 光敏剂聚集容易降低其单线态氧产量，降低了光动力抗肿瘤的治疗效果[7]。 ZnPc(TAP)4光敏剂带有12 个二甲氨甲基基团，pH 值的改变会影响其在水中的聚集程度。 配置不同pH 的缓冲液，研究ZnPc(TAP)4光敏剂的pH 灵敏性，分析ZnPc(TAP)4光敏剂的聚集情况有助于探索ZnPc(TAP)4光敏剂的活性。 结果如图1 所示，ZnPc(TAP)4光敏剂的紫外吸收最大峰位置随缓冲液pH 值升高发生了移动，当pH 值为8.0 时，Zn-Pc(TAP)4光敏剂的最大吸收峰位于650 nm 左右，光敏剂处于聚集状态；当pH 值降低至6.0 时，ZnPc(TAP)4光敏剂的最大吸收峰位转移到690 nm 左右，光敏剂处于单体状态。 证明ZnPc(TAP)4光敏剂具有灵敏的pH 响应性能。 同时，ZnPc(TAP)4光敏剂的荧光图谱随缓冲液pH 值的改变也发生了明显变化：当pH 值为 8.0 时，ZnPc(TAP)4光敏剂的特征荧光值较小；当pH 值降低至 6.0 时，ZnPc(TAP)4光敏剂的特征荧光值显著升高，达到6 000 左右，是pH 8.0 状态荧光值的30 倍。 此差异主要由于其的活性状态不同：pH 值为 8.0 时 ZnPc(TAP)4光敏剂处于聚集状态，pH 值为 6.0 时，ZnPc(TAP)4光敏剂处于单体状态。 进一步证明ZnPc(TAP)4光敏剂能够在1 个pH 单位内快速转变其活性，这一优势有利于提高药物的生物利用度。 据文献报道，人体内的正常生理环境或正常细胞的细胞外pH 约为7.4，而肿瘤细胞环境因其缺氧、产生大量的代谢物，导致周边肿瘤微环境维持偏酸性[8]，因此，ZnPc(TAP)4光敏剂所具有的灵敏pH 响应、单体和聚集体快速转换性能，有利于在抗肿瘤治疗中提高药物的利用度。 酞菁类光敏剂的荧光强度还与药物的光敏活性有关，高强度的荧光有利于药物对肿瘤进行光学成像，有助于肿瘤的诊断和治疗[9-10]。

图1 ZnPc(TAP)4 光敏剂的pH 灵敏性

2.2 ZnPc(TAP)4光敏剂在不同pH条件下的单线态氧产量

酞菁锌光敏剂在特殊波长光照条件下能够产生单线态氧，作用于周边环境，从而产生细胞毒性。 因此，检测ZnPc(TAP)4光敏剂的单线态氧产量具有重要意义。 实验结果如图2 所示。ZnPc(TAP)4光敏剂在不同pH 条件下均有单线态氧产生，且其单线态氧产量与pH 值的大小存在明显的负相关。 在pH 6.0 时，ZnPc(TAP)4光敏剂的单线态氧产量约是pH 8.0时的5 倍，证明ZnPc(TAP)4光敏剂在偏酸性环境中有更高的单线态氧产量。 结合ZnPc(TAP)4光敏剂的紫外和荧光特性，单线态氧产量的差异主要与其在不同pH 值条件下单体-聚集体转换性能有关。 pH 6.0 时ZnPc(TAP)4光敏剂处于单体状态，能够产生更多的单线态氧，这有助于提高ZnPc(TAP)4光敏剂的肿瘤细胞毒性。

图2 ZnPc(TAP)4 光敏剂在不同pH 条件下的单线态氧产量

2.3 肿瘤细胞和正常细胞对ZnPc(TAP)4光敏剂的药物摄取分析

研究细胞对ZnPc(TAP)4光敏剂的药物摄取量有助于分析药物的细胞毒性能力。 尤其是肿瘤细胞，其摄取ZnPc(TAP)4光敏剂的能力与肿瘤细胞毒性密切相关。 本实验研究人乳腺癌MCF-7 细胞和正常成纤维细胞HELF 对ZnPc(TAP)4光敏剂的药物摄取能力。 实验结果如图3 所示。 正常细胞和肿瘤细胞对ZnPc(TAP)4光敏剂的药物摄取能力和药物孵育时间呈现正相关性。 肿瘤细胞在前3 个小时快速ZnPc(TAP)4光敏剂，在12～24 h 区间仍然有显著的药物摄取。 相比于肿瘤细胞，正常细胞对ZnPc(TAP)4光敏剂的摄取要相对缓和，在前12 h 逐步摄取药物，并且在12 h 后趋于稳定， 达到摄取平台期。实验结果可证明相同的药物浓度和孵育时间情况下， 肿瘤细胞对ZnPc(TAP)4的摄取能力明显大于正常细胞。 肿瘤细胞对ZnPc(TAP)4光敏剂的摄取量约是正常细胞的2～3 倍。 这可能是由于肿瘤细胞表面通常带负电荷，ZnPc (TAP)4光敏剂能够更好地吸附于肿瘤细胞并且被肿瘤细胞摄取；同时，在肿瘤微酸性环境中，ZnPc(TAP)4光敏剂呈现单体状态，具有更好的药物活性。

图3 肿瘤细胞和正常细胞对ZnPc(TAP)4 光敏剂的药物摄取情况

2.4 ZnPc(TAP)4光敏剂的肿瘤细胞和正常细胞毒性

对于光动力治疗中使用的酞菁锌光敏剂，最重要的评价指标就是药物的细胞毒性[11-12]。 本文选取正常的成纤维细胞HELF 和乳腺癌细胞MCF-7 来研究ZnPc(TAP)4光敏剂的正常细胞和肿瘤细胞毒性。 成纤维细胞HELF 和乳腺癌MCF-7 细胞经过复苏活化至达到实验要求， 将细胞接种于实验板上。设置不同的药物浓度梯度 0.5，1，2，4，8 μmol/L，用 MTT 法检测细胞存活率。 实验结果如图4 所示，ZnPc(TAP)4光敏剂在设定的浓度范围内对乳腺癌细胞MCF-7 具有明显的肿瘤细胞毒性，在8 μmol/L 时就能够使95%的肿瘤细胞死亡；相比于肿瘤细胞，ZnPc(TAP)4 光敏剂对成纤维细胞HELF 的细胞毒性显著降低。 当药物浓度为2 μmol/L 时，ZnPc(TAP)4光敏剂对肿瘤细胞的毒性约是正常细胞的2～3 倍。这主要是由于肿瘤细胞在生长过程中产生的代谢物导致其处于微酸性环境， 而正常细胞的酸碱性相对平衡，处于偏中性的环境中。 ZnPc(TAP)4光敏剂在肿瘤细胞的微酸性环境中维持单体状态，其最大紫外吸收峰位于690 nm 左右，能够产生大量的单线态氧，实现了高效的肿瘤细胞毒性。而在正常细胞环境中，大部分ZnPc(TAP)4光敏剂最大紫外吸收峰处于650 nm 的聚集体状态，导致较少的单线态氧产量，降低了其对正常细胞的毒性。 因此，ZnPc(TAP)4光敏剂所具有的高灵敏pH响应性能赋予其独特的肿瘤细胞选择毒性，具有高效“靶向”杀伤肿瘤细胞的作用。

图4 ZnPc(TAP)4 光敏剂对细胞的毒性分析

3 结论

研究结果表明，ZnPc(TAP)4光敏剂具有灵敏的pH 响应性能，具有高效“靶向”杀伤肿瘤细胞的能力和较低的正常细胞毒性。 证明ZnPc(TAP)4光敏剂能够在1 个pH 单位内快速转变其活性，有利于提高药物的生物利用度：药物在生理条件（生理pH 约7.4）下具有较低的细胞毒性，保证药物的稳定性和体内安全运输；当药物到达肿瘤微酸性环境时（肿瘤微环境pH 约 6.5），能够从聚集态转变成更有活性的单体状态，实现更好的肿瘤细胞毒性作用。 同时，ZnPc(TAP)4光敏剂在微酸性环境中，其荧光显著增强，有助于对体内肿瘤进行光学成像和诊断。 目前国内外已报道的应用于临床诊断的光敏剂药物包括四环素、金丝桃素、血卟啉衍生物(HpD)、5-氨基酮戊酸(ALA)及其酯类衍生物氨基酮戊酸己酯( HAL) 等。其中5-氨基酮戊酸( ALA)/PpIX 荧光成像利用激光光敏技术可以看到发射红色荧光的增生组织，可辅助病变定界、识别残留病灶、提高照光成功率和减少复发[13]。虽然如此，目前绝大多数的光敏药物在临床治疗和诊断过程中仍然面临较大挑战，本课题研究的ZnPc(TAP)4光敏剂在肿瘤治疗和荧光诊断方面具有鲜明特点，对于更好地推进光敏剂的临床应用具有一定的参考价值和前景。