桂枝汤通过抑制淋巴细胞向Th2细胞分化抑制变应性接触性皮炎

吴 鹏，魏 盼，李恋曲，王晓钰，贾志荣，洪 敏

(南京中医药大学，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210046)

近几十年来，世界范围内的过敏性疾病发病率急剧升高。变应性接触性皮炎是最常见的过敏性疾病之一，是一种多基因病，34%以上的欧洲人口都受其侵扰[1-2]。变应性接触性皮炎是一种由半抗原致敏引起的抗原特异性T淋巴细胞介导的皮肤炎性疾病，主要表症为局部瘙痒、红疹、水肿等，病症持久且反复发作，严重影响患者的生活质量[3-4]。

桂枝汤首载与《伤寒论》，组方有五味，即桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣，是调和营卫的首选方。桂枝汤临床上常用于治疗过敏性皮炎、哮喘、关节炎等免疫性疾病[5-6]。淋巴细胞是机体免疫反应过程中直接的效应细胞。过敏性疾病主要由2型免疫反应介导，2型辅助T细胞(type 2 T help cells)在其中发挥重要作用[7-8]。已有研究表明，桂枝汤具有抑制T、B淋巴细胞增殖的作用[9]。桂枝汤是否通过抑制淋巴细胞向Th2型细胞转化，从而治疗过敏性疾病？基于此，本研究利用异硫氰酸荧光素(FITC)诱导的变应性接触性皮炎小鼠模型，探讨桂枝汤对变应性接触性皮炎模型的影响；并在体外提取小鼠的脾淋巴细胞，探讨桂枝汤是否影响淋巴细胞分化。

1 材料

1.1 实验动物BALB/c小鼠，SPF级，♂，4～6周龄，体质量(18～22) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司南京分公司，合格证证号：SYXK(苏)2014-0004。ICR小鼠，SPF级，♂，4～6周龄，体质量(18～22) g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，合格证号：SYXK(苏)2017-0001。

1.2 药物与试剂桂枝(批号20170601)为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，白芍(批号20170601)为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall的干燥根，甘草(批号20171115)为豆科植物Glycyrrhizauralensis的干燥根和根茎，大枣(批号20170601)为鼠李科植物枣Ziziphusjujuba的干燥成熟果实，以上4味药均购自南京中医药大学百草堂中医门诊部。生姜为姜科植物姜Zingiberofficinale的新鲜根茎，购自南大和园农贸市场。所有药物均由南京中医药大学谷巍教授鉴定，符合2015年版《中国药典》规定。丙酮(批号：20120803)、邻苯二甲酸二丁酯(批号：20130829)，上海凌峰化学试剂有限公司；FITC(批号：100125)，Sigma公司；小鼠IL-4 ELISA试剂盒(批号：E09338-1631)、IL-5 ELISA试剂盒(批号：4277363)、IL-9 ELISA试剂盒(批号：E16520-112)、IFNγ ELISA试剂盒(批号：4308729)、IgE ELISA试剂盒(批号：123956012)、IL-10 ELISA试剂盒(批号：4315167)，均购自美国eBioscience；地塞米松注射液(批号：1512072111)，辰星药业股份有限公司；RPMI 1640培养基，Gibco公司；胎牛血清，CAPRICORN SCIENTIFIC；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)，Solarbio，批号：927G032；TRIzol(批号：7E191L7)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(批号：7E140L7)、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(批号：7E181G7)，均购自Vazyme。

1.3 仪器SI403电子天平、BSA423S-CW分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；7301测厚规(日本mitutoyo)；SyneRgy 2酶标仪(美国Bio-Tek)；GS-15R台式冷冻离心机(美国BECKMAN)；BX43倒置显微镜(日本OLYMPUS)；MCO-20AIC CO2细胞培养箱(日本三洋)；ABI7500 PCR仪(Applied Biosystems)。

2 方法

2.1 药物制备桂枝汤处方如下：桂枝9 g、芍药9 g、甘草6 g、生姜9 g、大枣18 g。按配齐药物561 g，水煎2次合并煎液，减压浓缩至2.24 kg·L-1。

2.2 变应性接触性皮炎小鼠模型

2.2.1建立变应性接触性皮炎小鼠模型 BALB/c小鼠在d 0腹部剔毛(3 cm×3 cm)，d1、2腹部涂抹80 μL质量分数为1.5% FITC溶液进行致敏，d 6向小鼠右耳涂质量分数为0.6% FITC溶液20 μL进行激发，对照组涂等体积的溶剂[邻苯二甲酸二丁酯(V)∶丙酮(V)=1∶1]。24 h后，测量小鼠左右耳的厚度，计算耳肿胀度(耳肿胀度=右耳耳厚-左耳耳厚)；用8 mm直径的打孔器在左右耳同一位置敲取耳圆片，称重，-80 ℃保存备用。

2.2.2分组和给药 将小鼠随机分为5组，分别为空白组、模型组、阳性对照组(地塞米松3.35×10-4g·kg-1)、桂枝汤组(2.21、6.63 g·kg-1)，每组6只。每天给药1次，连续7 d，阳性对照组腹腔注射，桂枝汤组灌胃给药，空白组以及模型组灌胃给予相同体积的生理盐水。

2.2.3小鼠耳组织病理学检查 激发24 h后，取小鼠右耳耳廓，于福尔马林液中固定。固定后，进行石蜡包埋，常规切片，HE染色，于BX43倒置显微镜下采集图像。

2.2.4耳组织匀浆制备和ELISA法检测细胞因子的表达 圆耳片精密称重后，用预冷的PBS制成质量分数为2.5%的匀浆，4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，取上清液保存于-20 ℃，待测。按试剂盒说明书检测耳组织匀浆中的细胞因子。

2.3 脾淋巴细胞Th1/Th2分化

2.3.1小鼠脾淋巴细胞的提取和培养 ICR小鼠脱颈椎处死，浸泡于75%的乙醇中10 min；取小鼠脾脏，用D-Hank′s冲洗两遍；在盛有8 mL D-Hank′s的培养皿中，用玻璃注射器针芯研磨脾脏；经200目滤布过滤细胞悬液，转移至10 mL离心管中；1 500 r·min-1离心3 min，弃上清，加红细胞裂解液3 mL重悬，室温静置3 min；加入D-Hank′s 5 mL，1 500 r·min-1离心3 min，弃上清液；加入8 mL D-Hank′s重悬细胞，1 500 r·min-1离心3 min；重复两次后，加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基3 mL重悬细胞，并计数，调整细胞浓度至3×109·L-1，检测细胞存活率>95%，置于冰上备用。

2.3.2细胞增殖的检测 将小鼠脾淋巴细胞分为8组，分别为空白组和桂枝汤各剂量组(0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 mg·L-1)，每组均设3个复孔。桂枝汤各剂量组加入对应剂量药液，空白组加入同体积的RPMI 1640完全培养基。培养箱中培养48 h后，1 000 r·min-1离心3 min，小心吸去上清，每孔加入不含血清的RPMI 1640培养基100 μL以及MTT溶液(5 mg·L-1) 10 μL。培养箱中继续培养4 h后，每孔加入三联液100 μL，于37 ℃烘箱中孵育过夜。次日在490 nm处检测OD值，根据OD值判断桂枝汤对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。

2.3.3细胞分组和给药 将小鼠脾淋巴细胞分为5组，分别为空白组、ConA组(5 mg·L-1)、桂枝汤各剂量组(1、10、100 mg·L-1)，每组3个复孔，于6孔细胞培养板中培养。模型组和桂枝汤各剂量组分别加入预先配好的含有ConA和桂枝汤的药液，空白组加入同体积的RPMI 1640完全培养基。48 h后，收集上清液，-20 ℃保存，待测，底部细胞加PBS 1 mL，待提RNA。

2.3.4检测细胞上清中IL-4、IL-10、IFNγ水平 按照ELISA说明书，检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-4、IL-10、IFNγ水平。

2.3.5检测脾淋巴细胞中IL-4、IL-10、IFNγ、GATA3、T-bet基因的表达水平 离心管底部细胞加入1 mL PBS重悬，转移至1.5 mL去酶EP管中，1 000 r·min-1离心3 min。弃上清，加0.5 mL TRIzol试剂提取RNA，冰上静置5 min；加入氯仿100 μL，震荡20 s，冰上静置15 min；4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min；将上层无色水相转移至新去酶EP管中，加入异丙醇0.5 mL，混匀，冰上静置10 min；4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min；弃上清，每管加入75%乙醇50 μL，清洗RNA，冰上静置10 min；4 ℃、7 500 r·min-1离心5 min；吸去乙醇，置于冰上挥干乙醇；加DEPC水20 μL，溶解RNA；检测RNA的纯度和浓度。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成DNA，再按照PCR扩增试剂盒说明书进行操作。各基因引物序列见Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of genes

Tab 2 Effects of GZD on levels of IL-4, IL-5 and IL-9 in ear homogenates of ACD mice

3 结果

3.1 桂枝汤对小鼠变应性接触性皮炎的影响

3.1.1桂枝汤对耳肿胀度的影响 如Fig 1所示，与空白组相比，模型组的耳肿胀度明显升高；与模型组相比，桂枝汤2.21、6.63 g·kg-1组能明显降低模型小鼠的耳肿胀度，桂枝汤6.63 g·kg-1还能明显下降小鼠的耳厚差。

3.1.2桂枝汤对耳组织病理学的影响 如Fig 2所示，相较于空白组，模型组小鼠耳组织明显增厚，存在大量的炎性细胞浸润，组织水肿。与模型组相比，桂枝汤2.21、6.63 g·kg-1组耳组织中炎性细胞浸润明显减少，耳肿胀程度明显减轻。

3.1.3桂枝汤对耳组织匀浆中Th2型细胞因子的影响 Tab 2结果显示，与空白组相比，模型组小鼠耳组织匀浆中的Th2型炎症因子IL-4、IL-5、IL-9水平明显上升；与模型组相比，桂枝汤组小鼠耳组织匀浆中IL-4和IL-9水平明显下降；但对IL-5的水平未见明显影响。

3.1.4桂枝汤对耳组织匀浆中IFNγ以及血清中IgE的影响 如Fig 3所示，与空白组相比，模型组小鼠耳匀浆中IFNγ以及血清中IgE的水平明显升高，给予桂枝汤能明显抑制IFNγ和IgE的表达水平。

3.2 桂枝汤对脾淋巴细胞分化的影响

3.2.1桂枝汤对脾淋巴细胞增殖的影响 MTT法检测桂枝汤对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，Fig 4结果显示，桂枝汤对脾淋巴细胞的增殖无明显影响。

Fig 1 Effects of GZD on ear swelling(A)and ear weight(B) of ACD mice

3.2.2桂枝汤对ConA刺激小鼠脾淋巴细胞分泌Th2和Th1型细胞因子的影响 Tab 3结果显示，与空白组相比，模型组上清中IL-4和IL-10的水平明显升高。桂枝汤各剂量能明显抑制IL-4和IL-10的表达。与空白组相比，模型组脾淋巴细胞分泌IFNγ水平明显升高，桂枝汤10、100 mg·L-1能明显抑制IFNγ的表达。

Fig 2 Effect of GZD on histopathology of ear tissues of mice(HE×200)

Fig 3 Effects of GZD on IFNγ(A) in ear homogenates and IgE(B) in serum

3.2.3桂枝汤对小鼠脾淋巴细胞中Th2和Th1相关基因表达的影响 Tab 4结果显示，在ConA刺激下，模型组细胞中Th2细胞因子IL-4、IL-10以及Th2细胞特征性转录因子GATA3基因的表达明显升高，但桂枝汤各剂量均能明显抑制IL-4、IL-10及GATA3基因的表达水平。在ConA刺激下，模型组细胞中Th1细胞因子IFNγ以及Th1细胞特征性转录因子T-bet的基因表达水平明显升高，桂枝汤各剂量能明显降低IFNγ的基因表达水平，对T-bet的基因表达水平也有一定程度的下降作用。

4 讨论

过敏性疾病是机体对抗外来抗原，产生异常免疫反应所引起的疾病，过敏性疾病过程中以2型免疫反应占主导作用，而Th2细胞就是许多过敏性疾病发病的核心[10]。T细胞分化为Th2细胞是由Th2特征性转录因子GATA3所调控的[11]。GATA3能促进IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13等2型炎症因子基因的转录和表达，从而促进2型细胞因子的分泌，引起机体的2型免疫症状[12]。除了2型免疫反应，1型免疫反应在过敏性疾病发生和发展过程中也有重要作用。哮喘患者[13]以及过敏性皮炎小鼠[14]体内，IFNγ表达水平较高。且研究表明，IFNγ与重度哮喘患者和小鼠的气道高反应有关[13]。

中医认为，过敏性疾病是属于内外共同发作的疾病，该病主要是由于正气内虚，营卫不和。因此，中医认为，该病的治疗不能只缓解其临床症状，还应当调理患者失和之营卫。桂枝汤首载于《伤寒论》，能调和营卫，燮理阴阳，历代医家称此方为仲景“群方之冠”。临床应用显示，桂枝汤能明显改善过敏性鼻炎、哮喘等患者的发病症状，并减少疾病的复发。本研究采用FITC诱导的变应性接触性皮炎小鼠模型，探究桂枝汤治疗过敏性疾病的作用。FITC是一种半抗原，其所引起的是一种2型免疫反应[15]。结果显示，给予桂枝汤能明显降低模型小鼠的耳肿胀度，缓解耳组织炎性细胞浸润，并且还能降低IL-4、IL-9、IFNγ、IgE的水平，明确提示了桂枝汤对变应性接触性皮炎的治疗作用。

为进一步探讨桂枝汤抑制2型免疫反应的作用机制，研究探索了桂枝汤对Th2型淋巴细胞的影响，这类细胞直接介导2型免疫反应。研究发现，桂枝汤能明显降低脾淋巴细胞中Th2型特征性转录因子GATA3基因以及IL-4、IL-10的水平。此外，桂枝汤还能抑制IFNγ的表达，但对Th1细胞特征性转录因子T-bet的表达并无明显影响。提示桂枝汤对脾淋巴细胞向Th2型分化具有抑制作用，同时也能一定程度上抑制Th1细胞，从而缓解2型免疫反应症状。这可能是桂枝汤治疗过敏性疾病的机制，值得进一步探讨。

Tab 3 Effects of GZD on expression of IL-4, IL-10 and IFNγ in splenic lymphocytes stimulated by ConA

Tab 4 Effects of GZD on gene expression of Th2 and Th1 associated factors in splenic lymphocytes stimulated by ConA

Fig 4 Effect of GZD on proliferation of splenic lymphocytes