不同途径接种衣原体后小鼠多脏器衣原体检测分析

邵丽丽 马璟玥 练婷婷 魏世娟 任杰 刘全忠

天津医科大学总医院皮肤科 天津性传播疾病研究所300052

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）泌尿生殖道感染是近年来国内外常见性传播疾病，危害严重，引起一系列的并发症和后遗症，在女性患者中引起慢性输卵管炎、慢性盆腔炎，不孕等［1］，Ct感染所致的输卵管性不孕约占10%～20%［2］。多年来一直认为这些并发症和后遗症是由于衣原体生殖道持续感染所致，但研究显示，感染后期的输卵管病变局部组织几乎检测不到衣原体，多认为这种病理变化是由于免疫反应所致［3］，但持续的免疫刺激来源成了疑问。越来越多的研究［4-5］提示，肠道微生态与机体免疫和疾病有着密切关系，我们设想衣原体是否也存在于肠道微生态中并起着重要作用。我们应用鼠衣原体（Chlamydia muridarum，C.muridarum）即鼠肺炎衣原体（Mouse pneumonitis，MoPn）感染小鼠生殖道，经多部位检测，观察鼠衣原体能否从阴道感染传播至生殖道以外的其他组织器官并长期持续存在。

材料与方法

一、主要试剂及仪器

AX-70荧光显微镜（日本Olympus公司）、组织匀浆仪器（美国Kennesaw Omni公司）、超声破碎仪（日本SANYO公司）、组织匀浆管（美国KennesawOmni公司）、DNA提取试剂盒（美国Genesee Scientific公司）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔二抗（美国Sigma公司）、孕酮（Depo-provera，美国Pharmacia Upjohn公司）等。

二、实验动物、菌株、细胞株

实验动物：5～6周龄雌性C57BL/6J小鼠120只，购于军事医学科学院，分成4组，分笼饲养（每笼5只）并做好标记，所有动物均饲养在本院中心实验室动物室，温度为20～24℃，光暗周期12 h下饲养。实验所使用的鼠衣原体菌株由美国德州大学微生物与免疫学系钟光明教授提供，本实验室自行传代并纯化保存有感染能力的原体（elementary bodies，EB）；HeLa细胞株，用于体外培养衣原体，购自美国细胞株保存中心（ATCC，cat#CCL-2.1）。

三、动物分组及处理

实验小鼠分4组：阴道接种组、灌胃接种组、肛门直肠接种组、眶后静脉丛接种组，每组均设有蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲液（SPG）阴性对照组。不同感染组小鼠均在感染后第3、7天及此后每隔7天用拭子取阴道及直肠分泌物，检测拭子中脱落细胞感染衣原体的数量。

1.阴道接种组：实验组35只，阴性对照组5只。感染前5天每只小鼠皮下注射2.5 mg孕酮，同步化小鼠生理周期以促进小鼠对EB的易感性；将-80℃冰箱冻存的EB用SPG缓冲液稀释后，在实验组小鼠阴道后穹窿处接种10μl含2×105包涵体形成单位（IFU）EB。对照组小鼠接种同体积的SPG缓冲液。为排除小鼠自食或通过粪口途径污染胃肠道，每只小鼠均带上直径3 cm的颈圈。实验组于接种后第7、14、28、56、105天分别处死5只小鼠，分离小鼠生殖道（阴道及与宫颈连接处组织、两侧宫角及卵巢）、胃肠道（直肠、结肠、盲肠、小肠、胃）及肠外组织器官（心、肝、脾、肺、肾）分段匀浆，分别用免疫荧光法及定量PCR检测不同时间点不同组织中衣原体活菌量和基因组。另外实验组在感染第56天及105天各处死5只小鼠，阴性对照组分别处死3只、2只小鼠，分离生殖道及胃肠道组织，迅速拍照后甲醛固定，肉眼及HE染色观察生殖道输卵管积水的评分、输卵管积水的发生率、炎症程度及胃肠道组织病理变化。

2.灌胃接种组：实验组30只，分为低剂量组及高剂量组各15只，阴性对照组5只，低剂量与高剂量组小鼠分别给予200μl含1×104及1×107IFU EB灌胃，对照组小鼠接种同体积SPG缓冲液。实验组在感染第28、56天，分别处死5只小鼠，分离生殖道、胃肠道及肠外组织，分段匀浆，检测不同组织中衣原体活菌量和基因组。实验组及对照组在感染第56天分别处死5只小鼠，分离生殖道、胃肠道组织，拍照后甲醛固定，观察组织病理变化。

3.肛门直肠接种组：分组同灌胃接种组，低剂量与高剂量组小鼠分别给予2μl含1×104及1×107IFU EB直肠内接种，后续处理同灌胃接种组。

4.眶后静脉丛接种组：实验组及阴性对照组各5只。麻醉小鼠，左手固定小鼠头部，食指按于眼球后使眼球突出，沿内眦眼眶后壁刺入，实验组小鼠接种100μl含2×105IFU EB，对照组接种同体积SPG缓冲液。接种后的第3、5、7、10、14天小鼠尾静脉取血，检测血中衣原体活菌量及基因组。感染第56天处死小鼠，生殖道、胃肠道组织甲醛固定，观察组织病理变化。

四、间接免疫荧光法检测活菌量

将用拭子取的阴道及直肠分泌物、不同组织分段匀浆、小鼠尾静脉血，825×g离心5 min后，取50μl上清液接种至已制备的致密单层HeLa细胞，37℃、CO2培养箱中继续培养20～22 h。采用免疫荧光染色检测标本中活衣原体的数量，一抗为兔抗鼠肺炎衣原体EB（实验室自行制备，1∶2 000稀释），二抗为FITC标记的羊抗兔IgG（绿色荧光，1∶300稀释），荧光显微镜下观察，计数标本中衣原体数量。根据5个视野下包涵体的平均值及不同的稀释浓度和放大倍数计算每个标本中衣原体的IFU，以10为底数对数（lg）转换，计算各组在每个时间点的菌量。

五、定量PCR检测感染后不同时间点血液中及不同组织中衣原体的数量

按DNA小规模提取试剂盒说明书提取阴道及直肠分泌物、不同组织的分段匀浆、小鼠尾静脉血DNA，采用10μl反应体系，95℃变性3 min，95℃扩增15 s，60℃退火1 min，40个循环。qPCR引物由苏州金唯智（北京）生物科技有限公司合成，16S rRNA编码区域正向引物：5′-CGCCTGAGGAGTAC ACTCGCAGGA-3′，反向引物：5′-CCAACACCTCAC GGCACGAG-3′；探针：5′-CACAAGCAGTGGAGCAT GTGGTTTAA-3′。计算得到基因拷贝数，计算值以10为底数对数（lg）转换，计算各组每个时间点的基因拷贝数。

六、输卵管积水评分及生殖道、胃肠道组织病理观察

输卵管积水评分标准［6］：0分，无明显水肿；1分，输卵管直径小于卵巢直径，肉眼不可见，需用放大镜观察；2分，有明显水肿，但输卵管直径仍小于卵巢直径；3分，输卵管直径等于卵巢直径；4分，输卵管直径大于卵巢直径。分离生殖道及胃肠道组织行常规组织病理检查，HE染色观察组织炎症情况。

七、数据统计

结 果

一、阴道接种组小鼠胃肠道衣原体定植情况

感染后第7天时，检测5只小鼠的阴道均感染衣原体，在每只小鼠的生殖道、胃肠道及肠外组织中均检测到活菌和基因组，其中阴道及与宫颈连接处组织即接种处的菌量最高（图1）；第14天时在每只小鼠的生殖道、胃肠道及肠外组织中亦检测到活菌和基因组；第28天时，肠外组织器官中均未检测到活菌，仅在肝脏及脾脏中可检测到衣原体基因组，生殖道和胃肠道组织仍可检测到活菌，但滴度较前减少；第56天时，除在胃肠道组织中能检测到活菌与基因组外，其他组织均未检测到；第105天时，每只小鼠的胃肠道组织中仍能检测到活菌与基因组。见图1。

图1 小鼠阴道接种鼠衣原体后7～105 d采用免疫荧光及定量PCR检测衣原体在体内的感染分布情况（n=5）

阴道拭子分泌物显示，鼠衣原体在感染3～14 d时明显增殖，第21～35天时数量减少，自第42天时无法检测到活菌。肛门直肠拭子分泌物显示，在感染第7天时开始检测到活菌，至第49天活菌量维持相对平稳，从第56天时，检测到的活菌数量开始相对减少，但至第105天时仍能检测到活菌。见图2。

图2 小鼠阴道接种鼠衣原体后免疫荧光检测3～105 d阴道及肛门直肠拭子脱落细胞中衣原体的活菌量（n=5）

二、灌胃接种组、肛门直肠接种组小鼠胃肠道衣原体定植情况

灌胃接种组、肛门直肠接种组小鼠，在接种第28天时，胃肠道均能检测到衣原体活菌和基因组；第56天时，仅在盲肠、结肠、直肠中检测到衣原体活菌，胃、小肠中未检测到活菌，但仍可检测到衣原体基因组。两组小鼠生殖道及肠外组织中均未检测到活菌与衣原体基因组。见图3。

肛门直肠拭子分泌物显示，灌胃接种低剂量（1×104IFU）的衣原体后，每只小鼠在第7天时均在直肠中检测活菌，之后维持在相对稳定的水平；接种高剂量（1×107IFU）衣原体后，在第3天时即有3只小鼠检测到活菌，至第7天，所有小鼠均检测到活菌，与低剂量组相比鼠衣原体未在胃肠道中形成爆发性增长。肛门直肠接种组所有小鼠在第3天时即检测到活菌，两剂量组检测到活菌数相当。两种感染途径均未在阴道拭子分泌物中检测到活菌。见图4。

图3 灌胃接种、肛门直肠接种小鼠衣原体后28、56 d采用免疫荧光及定量PCR检测衣原体在体内的感染分布情况（n=5）

图4 灌胃接种、肛门直肠接种以高、低剂量小鼠衣原体后免疫荧光检测3～56 d肛门直肠拭子脱落细胞中衣原体的活菌量（n=5）

三、眶后静脉丛接种组小鼠胃肠道衣原体定植情况

每只小鼠接种后第3、5、7、10天在血液中检测到衣原体基因组拷贝数常用对数值分别为2.97±0.21、2.44±0.45、3.01±0.35、2.94±0.47，第14天仅有3只小鼠检测到衣原体基因组拷贝数常用对数值为1.00±0.43，所有小鼠在这些时间点未检测到活菌。至接种后第14天每只小鼠在肛门直肠拭子中检测到衣原体活菌常用对数值为4.93±0.19，并持续存在至第56天（图5），但阴道拭子一直未检测到衣原体活菌。

图5 眶后静脉丛接种小鼠衣原体后免疫荧光检测3～56 d肛门直肠拭子脱落细胞中衣原体的活菌量

四、不同途径接种鼠衣原体后小鼠生殖道及胃肠道的病理变化

以第56天为例，阴道接种组小鼠接种衣原体后，5只小鼠的生殖道形成严重的输卵管积水及慢性炎症、输卵管扩张（图6），小鼠输卵管积水评分（5.6±2.07），正常对照组未见到明显异常；胃肠道形态及长度与正常小鼠相比无明显差异，小鼠肠道黏膜层及黏膜下层均未见明显的慢性炎症细胞浸润。接种后第105天，生殖道及胃肠道的病理变化与第56天时相似。灌胃接种组、肛门直肠接种组、眼眶后静脉丛接种组第56天，生殖道及胃肠道均未见到明显的炎症病理变化。

图6 阴道接种组小鼠接种后第56天时生殖道及胃肠道组织病理表现

讨 论

传统观点认为Ct主要通过性接触传播，引起泌尿生殖道炎症反应。小鼠模型是研究Ct泌尿生殖道感染常用的动物模型。小鼠阴道感染Ct后，病原体主要集中在下生殖道，由于炎症病变轻微，机体免疫系统能够很快将其清除，不易引起上生殖道病变［7］，不适合用于致病机制研究。鼠肺炎衣原体是一种Ct生物变种，属于鼠衣原体属，其基因组与Ct D血清型有超过90%同源性，基因编码产物与Ct相似，并且对雌性小鼠生殖道的致病性很强，小鼠阴道感染鼠衣原体后引起的炎症反应和后遗症与女性生殖道感染Ct相似［8-9］，故常用来研究沙眼衣原体在人类的致病机制。本实验用鼠衣原体接种小鼠生殖道和直接灌胃、肛门直肠接种及眶后静脉丛接种鼠衣原体，来验证我们的设想。

曾有实验提示衣原体能够感染肠道，Dlugosz等［10］用人类肠道内分泌细胞系体外培养成功分离出Ct，未验证人体肠道环境下分泌细胞中是否存在衣原体。Perry和Hughes［11］发现，鼠衣原体生殖道感染后14 d能够在胃肠道检测到衣原体，仅检测到21 d，也未明确衣原体在胃肠道的具体分布情况及是否引起病变。本实验用间接免疫荧光及定量PCR检测各组小鼠胃肠道鼠衣原体活菌及基因组，发现鼠衣原体的确可以在胃肠道定植，并长期生存。鼠衣原体自小鼠阴道接种第7天就开始传播至胃肠道，第14天衣原体增殖变多，第28天、49天衣原体胃肠道生长趋于平稳，直至105天，衣原体仍能在胃肠道存活。通过直接灌胃及肛门直肠接种高低两种剂量（相差1 000倍）的鼠衣原体后，发现即使降低衣原体的接种量，衣原体仍可在胃肠道长期定植，提示胃肠道是衣原体长期定植场所。同时还发现生殖道及直肠拭子的检测结果与生殖道及胃肠道组织分段检测衣原体变化趋势相似，提示检测阴道及肛门直肠拭子脱落细胞衣原体的活菌量能间接反应生殖道及胃肠道组织中衣原体感染情况。

衣原体是通过何种途径从生殖道传播到胃肠道的？本实验小鼠均带颈圈，能够避免小鼠吞食污染了衣原体的分泌物，仍然在胃肠道形成持续的衣原体感染。早期的流行病学资料发现在某些患者的口腔、肛门直肠也检测到沙眼衣原体，一度认为是由口腔/肛交的性行为所致［12］。最近针对南非及加拿大性病门诊女性患者的两项调查研究显示，直肠沙眼衣原体感染的检出率分别为7.1%［13］和10%［14］，这些研究均排除有口交及肛交的性行为，这些研究也提示衣原体从生殖道传播到胃肠道不是经口或者肠道污染所致。本实验中，阴道接种感染后小鼠的肝、肺、脾等多个器官中均检测到活的衣原体，推测可能是通过血液传播所致。为验证这个的猜测，我们用鼠衣原体眶后静脉丛接种小鼠，以避免输入性污染，鼠尾静脉取血发现，在接种后的第14天仍然能够在血中检测到衣原体基因组，并在胃肠道检测到衣原体活菌，之后在胃肠道长期定植，整个感染过程中，均未在生殖道中检测到衣原体活菌，亦提示了胃肠道是衣原体长期定植的场所，这与文献报道鼠尾静脉接种鼠衣原体［15］的结果一致。另外，Reiter综合征患者的关节滑膜组织中检测到Ct DNA［16］，López-Hurtado等［17］在人体血液样本中也检测到Ct DNA，进一步证实衣原体能通过血液传播。

多年来一直认为衣原体感染引起上生殖道的并发症和后遗症是由于衣原体生殖道持续感染所致。我们的研究显示，鼠衣原体在生殖道的感染大约在35 d左右被完全清除，而输卵管积水及纤维化的形成发生在56 d以后，而此时生殖道中已没有衣原体活菌存在。Chen等［18］对多个种属的小鼠实验均有类似结果，生殖道衣原体感染的清除时间要明显早于输卵管水肿、纤维化的产生。有研究［3］提示，这种病理变化是由免疫病理所致，但在这样一个长期持续的过程中，特异的、持续的免疫刺激来源一直未明，目前成为衣原体免疫病理学亟待解决的问题。

近年来多项研究显示，肠道微生物菌群对人体健康起着重要作用，与人体有协同进化的共生关系，赋予人体与之相关的特定功能，包括营养代谢、黏膜屏障结构完整性的维持、免疫调节和对抗病原体等。在微生态失调的情况下，微生物群的组成和功能发生改变，从而导致炎症、免疫激活等病理生理过程的发生［4-5］。本研究发现，衣原体能够在胃肠道长期定植，但不引起胃肠道的病理变化，在感染的后期衣原体更多存储在下消化道，我们推测，除了衣原体与肠道其他微生物相互制约外，还可能与肠道抗菌肽及固有免疫和适应性免疫建立新的平衡有关。而这个适应性免疫是否对生殖道产生明显的免疫病理反应，衣原体胃肠道的长期定植是否提供源源不断免疫刺激，是我们进一步的研究方向。

本研究仅以C57BL/6J品系小鼠为模型，样本量较少，可能影响结果，需扩大样本量及研究其他品系小鼠的感染情况，从而更全面了解衣原体在机体的感染分布情况及衣原体感染的传播途径等，为研究衣原体对人类的致病奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突