利用SSR标记构建我国亚麻品种DNA指纹图谱及遗传多样性分析

潘根，张义，赵立宁，陈安国，李建军，黄思齐，唐慧娟，常丽，张翠萍，邓勇，李德芳

（中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙410205）

亚麻（Linum usitatissimumL.）是一种重要的经济作物，广泛种植于中国西北和东北地区。亚麻茎制取的纤维是纺织工业的重要原料，亚麻种子含油量30%～45%，亚麻油富含亚麻酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，被广泛用于榨油及保健等行业［1]。目前而言，亚麻育种以品种间杂交选育为主，对杂交亲本亲缘关系正确评价是亚麻品种选育的关键。简单重复序列SSR（Simple Sequence Repeat），也称微卫星，是由1～6个核苷酸组成的基本序列串联重复构成的DNA片段，具有简便、快捷、稳定性好以及等位基因多样等特点［2]。目前，SSR分子标记已成功应用于亚麻的遗传多样性以及亚麻连锁图谱的构建等多方面［3-5]。Cloutier等［6]利用EST-SSR引物对23份亚麻种质资源进行了遗传多样性分析，发现亚麻品种间遗传背景狭窄；Wu等［7]利用基因组重测序所获得的62对基因组SSR引物较好地将48份亚麻品种分为纤用和油用两大类群。DNA指纹图谱是指某一品种所具有的区别于其他品种的特异性DNA片段，其以DNA标记为基础，具有多位点性、高变异性和简单而稳定的遗传性等优点［8]。前人关于亚麻指纹图谱构建已有相关报道，郝冬梅等［9]利用32对RAPD引物构建了26份亚麻材料的指纹图谱；李秋芝等［10]同样利用8对RAPD核心引物构建了100份亚麻材料的指纹图谱，但其所用标记主要集中于RAPD，未见利用SSR标记构建中国现育成的亚麻品种指纹图谱的研究报道。本研究拟采用SSR分子标记技术，通过96对SSR引物对24份亚麻品种进行遗传多样性分析，构建DNA指纹图谱，确定亚麻品种遗传基础和遗传多样性的状况，旨在为亚麻遗传育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

24份亚麻品种为中国近期育成，种植于中国农业科学院麻类研究所长沙试验基地，该批材料来自中国农业科学院麻类研究所麻类种质资源库（见表1）。

表1 亚麻品种名称、编号及系谱信息Table 1 Flax varieties name，number and pedigree information

续表1

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

取亚麻新鲜叶，参照张友昌等［11]的方法提取亚麻DNA。

1.2.2 PCR扩增

NCBI下载亚麻全基因组序列信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000224295.2），利用 MISA软件 （MIcroSAtellite identification tool）（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）检测亚麻基因组序列中的微卫星和复合微卫星位点。根据MISA的SSR检测结果，利用Primer 5.0软件默认参数（长度100～300 bp，Tm值55～60℃，引物长度20～25 bp）进行引物设计，在设计结果中挑选打分最高的3对引物用于后续试验，共得到71184对SSR引物。随机从中挑选96对SSR标记对24份亚麻品种进行DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析，引物由湖南擎科生物公司合成。PCR反应体系为10μL，包含7μL的2×Taq PCR MasterMix，前后引物共1.5μL，基因组DNA 1.5μL。PCR扩增程序如下:94℃预变性3min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，循环30次；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.2.3 电泳产物检测

PCR结束后在扩增产物中加入适量的Loading Buffer，进行40%聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量为1.5μL 1×TBE，180 V，电泳1～1.5 h（根据片段大小适当延长或缩短电泳时间）。电泳结束后将胶块银染显色，拍照，对清晰的条带进行读带。

1.3 数据处理与分析

根据PCR扩增结果，将同一引物扩增出的大小相同的目的条带视为1个等位变异，并进行记录。用同一引物对24份材料进行扩增检测时，相同的带型用同一数字赋值，无带赋值为“0”。采用NTSYS-pc 2.10e软件计算品种间遗传相似系数，并采用非加权平均法（UPGMA）计算品种遗传相似系数。

2 结果与分析

2.1 SSR标记在24个亚麻品种之间多态性分析

96对引物在24个亚麻品种中共检测出128个等位变异，每对引物检测出1～5个等位变异，平均每对引物检测出1.33个等位变异。其中，24对SSR引物在24个亚麻品种中具有多态性，有7对引物（RM5-1、RM6-2、RM10-6、RM13-5、RM8-1、RM13-2，RM9-4）可以将某一品种与其他品种（系）区分开，如引物RM5-1在“内亚9号”检测到的等位变异与其他品种不同，因此可以将“内亚9号”与其他品种区分开；同理，RM6-2可以将“坝亚4号”与其他材料区分开；RM10-6可以将“坝选3号”与其他品种区分开；RM13-5可将“张亚2号”与其他品种区分开；RM8-1可将“晋亚8号”、“陇亚杂3号”与其他品种区分开。此外，利用同一个引物还可以将2～3个品种从24个品种中区分开，如引物RM7-1可以将“陇亚7号”、“坝亚12号”与其他品种区分开；引物RM7-3可以将“陇亚7号”、“晋亚8号”和 “坝亚7号”与其他品种区分开；引物RM13-4可以将“晋亚8号”、“陇亚14号”和“黑亚16号”与其他品种区分开。其他引物在单独使用时不能筛选出24个亚麻品种中的一个或几个材料，但通过这24对引物可以将每个品种从24个品种中鉴定出。

图1 标记RM9-4在亚麻品种中的扩增结果Fig.1 Amplification results of flax varieties using SSR primer“RM9-4”

2.2 24份亚麻品种材料DNA指纹数据库的初步构建

因只有24对引物在品种间存在差异，故利用这24对引物对24个品种进行了DNA指纹图谱的构建，对每一对引物所扩增的条带进行统计，得到了每个品种的DNA指纹图谱数据库（表2）。24对引物共鉴定出56个等位变异，所检测的等位变异数目见表3。

表2 24对SSR引物构建的24个亚麻品种（系）的SSR指纹图谱Table 2 Construction of the SSR fingerprint bands of 24 flax varieties using 24 pairs of SSR primer

表3 品种间具有多态性的24对SSR引物Table 3 The information of 24 SSR primers

续表3

2.3 24份亚麻品种遗传多样性分析

利用聚类分析软件NTSYS对24对引物所检测到的56个变异位点进行聚类分析，结果如图2所示，供试材料的遗传相似系数在0.25～0.87之间，平均值为0.56。24个品种被分为三大类:第一大类包括“内亚9号”、“陇亚8号”、“坝亚13号”等10个品种；第二大类包括“张亚2号”、“陇亚12号”、“陇亚14号”等13个品种；第三大类只包括“坝选三号”1个品种。该聚类分析结果能在一定程度上反映这些品种间的亲缘关系，“定亚21号”的母本为“陇亚7号”，所以“定亚21号”和“陇亚7号”被聚类到同一小类群；“晋亚8号”和“坝亚7号”均以“红木-65”为其中一个亲本选育而来，因此聚为同一小类群。但同时也存在亲缘关系近，SSR聚类不一致的现象，如“张亚2号”、“陇亚12号”、“陇亚14号”为油用亚麻品种，但同“黑亚15号”、“黑亚16号”、“黑亚23号”及“中亚麻5号”等纤用亚麻品种聚为同一小类群。

图2 24份亚麻品种的SSR聚类分析（非加权平均法）Fig.2 SSR cluster analysis of 24 flax varieties（UPGMA）

3 讨论与结论

目前，品种间杂交仍是亚麻品种选育的主要途径，但由于长期的品种间杂交选育，亚麻品种间遗传变异小，遗传基础狭窄，一定程度上阻碍了亚麻遗传改良的进程。亚麻品种间遗传差异的研究对于亚麻遗传改良具有重要的意义。微卫星标记（SSR）具有扩增稳定、分布广泛、多态性高、操作简单等优点，被广泛地用于作物遗传多样性研究［12-13]。本研究利用96对SSR引物对中国不同地域选育的24份亚麻品种进行遗传多样性分析，其SSR标记在24个品种中多态性为25%，低于Soto-Cerda等（68.18%）［5]、Deng等（39.8%）［14]的研究结果，其可能原因为本研究所选品种均为我国北方近代选育品种。

利用分子标记对亚麻种质资源进行遗传多样性研究已有相关报道。利用275对EST-SSR引物，Cloutier等［6]分析了23份亚麻种质资源的遗传多样性，研究显示亚麻品种间遗传背景狭窄；Wu等［7]利用62对基因组SSR引物较好地将48份亚麻品种分为纤用和油用两大类群；黄文功等［15]利用10对ISSR引物对来自7个国家48份亚麻资源进行了遗传多样性分析，地理位置相近的品种基本被聚为一类。与Wu等研究结果相近，基于亚麻最新的基因组序列信息［16]，本研究利用24对SSR引物对24份亚麻品种进行聚类分析，其纤用品种也较好地聚为一个小类群，以“内亚9号”和“陇亚8号”为代表的油用品种也被聚类到一个类群，这些研究表明，SSR标记能有效地用于品种间遗传多样性分析。同时本研究也发现，“张亚2号”、“陇亚12”、“陇亚14号”为油用亚麻品种，但和“黑亚15号”、“黑亚16号”、“黑亚23号”及“中亚麻5号”等纤用亚麻品种聚为同一小类群。出现这一现象一方面可能因为本研究所用SSR标记数目偏少，未能平均分布于亚麻染色体上；另一方面可能与当前亚麻资源频繁的异地引种有关。