心康冲剂调控慢性心衰大鼠miRNA1、miRNA133/caspases抗心肌凋亡*

刘蓉芳，谭 雄，张 辉，毛湘屏，杨 柳，陈志成，毛以林△

(1. 江门市五邑中医院，广东 江门 529000； 2. 湖南中医药大学第二附属医院,长沙 410005)

慢性心力衰竭(CHF)是心脏排血量绝对或相对不足，组织血流灌注不足及肺循环和(或)体循环瘀血为主要表现的一种疾病，其基本病理生理基础是心脏重构(cardiac remodeling,CR)，心肌细胞凋亡是其中1种。慢性心力衰竭(CHF)发生发展过程中，如肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、氧化应激、致炎细胞因子、缺血、压力或容量负荷过重、缺氧等均可诱导心肌细胞凋亡[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是存在于真核生物中的非蛋白质编码RNA分子，主要通过与靶基因mRNAs3’非编码区结合，降低mRNA分子的稳定性，导致其降解或抑制靶mRNA转录后翻译过程实现调控靶基因表达[3-4]，并可通过调控半胱胺酸天冬氨酸酶(caspases)家族蛋白表达，从而调控心肌细胞凋亡[5]。微小RNA-1(microRNA-1，miRNA-1)和微小RNA-133(microRNA-133，miRNA-133)是肌肉组织特异性表达miRNA，在肌肉及心脏中具有重要作用，并均可通过调控半胱胺酸天冬氨酸酶(caspases)家族蛋白表达，从而调控心肌细胞凋亡[5]。心康冲剂前期研究显示，其对慢性心力衰竭具有抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)作用[6]，并下调心力衰竭大鼠下丘脑精氨酸加压素(arginine vasopressin，AVP)mRNA及肾脏尿液水通道蛋白-2(aquaporin-2，AQP2)mRNA的表达，从而减少水钠潴留[7-8]，改善心肌重构[6]。本研究观察心康冲剂调控慢性心力衰竭大鼠miRNA1、miRNA133/caspases基因表达作用，探讨其抗心肌凋亡的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

5周龄SPF级SD大鼠90只，购于湖南斯克达实验动物有限公司(实验动物合格证号43004700025096)，体质量(150～180) g，雌雄各半。

1.2 药品及仪器

注射用盐酸阿霉素(深圳万乐药业有限公司，批准文号国药准字H44024359)；miRNA引物(上海生工合成)；caspase-3(美国CST，Rabbit，1∶1000，货号#9662)；caspase-9(美国proteintech，Rabbit，1∶200，货号10380-1-AP)；actin(美国proteintech，Mouse，1∶4000，货号60008-1-Ig)；二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(美国proteintech)；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美国proteintech)；末端脱氧核苷酸转移酶(TdT，上海江莱生物科技有限公司，批号9027-67-2)；心康冲剂(湖南省中医院中药制剂室制备)；引物(上海生工合成)。Motic B5 显微摄像图像分析系统(麦克奥迪)；OLYMPUS BX43型双目生物摄像显微镜(日本)；LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司)；便携式彩色多普勒超声仪(徐州大为DW-PF522)。

2 方法

2.1 动物分组及造模

动物适应饲养1周后随机取10只作为正常组，余下大鼠行阿霉素造模，造模方法参考文献[9]。超声心动图检测左心室短轴缩短率(LVFS)<30%[10]，即为心衰造模成功。80只模型成功大鼠再按随机数字表法分为阿霉素模型对照组(模型组)、心康冲剂等效剂量组(低剂组)、心康冲剂2倍等效剂量组(中剂组)、心康冲剂4倍等效剂量组(高剂组)、芪苈强心胶囊对照组(对照组)各16只。

2.2 药物制备及给药

心康冲剂溶液配制：白参10 g，黄芪30 g，柴胡5 g，升麻5 g，桔梗5 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g，陈皮10 g，桂枝6 g，制附片10 g，砂仁6 g。经湖南省中医院药剂科制成干燥颗粒后，按成人等效剂量(低剂)、2倍等效剂量(中剂)、4倍等效剂量(高剂)配制成心康冲剂浓度分别为0.6 g/ml、1.2 g/ml、2.4 g/ml的溶液，对照组溶液按成人等效剂量配置成浓度为0.073 g/ml的芪苈强心胶囊溶液，大鼠给药剂量按人和动物体表面积折算[11]。灌胃量=给药剂量/各组相应溶液浓度，每次灌胃约1～2 ml。正常组、模型组给予等体积生理盐水灌服，各组均每日1次,连续灌服8周，8周后实验结束进行取材。

2.3 指标及检测方法

2.3.1 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡 打开胸腔剪下心脏，去掉心房及右室，剪取心尖投入液化氮冻存，24 h后转移至-80 ℃低温冰箱。余下左心室投入10%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片，依次二甲苯透明、梯度乙醇脱水、PBS漂洗，50 μL TdT+450 μL荧光素标记后反应10 min。再加50 μL TUNEL反应混合液PBS漂洗，DAPI染色、封片。

2.3.2 Real-time PCR法检测心肌组织miRNA-1、miRNA-133及caspase-3 mRNA、caspase-9mRNA表达 表1显示，取出低温冰箱冻存的大鼠左心室心尖部分1 g，Trizol法提取大鼠心脏组织总RNA，行RNA琼脂糖凝胶电泳。取2 μg以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min，冰上冷却。以各检测基因引物(引物序列如下)进行实时定量PCR。定量PCR扩增条件，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。收集每循环第3个步骤荧光信号量，以2-ΔΔCt反映各样品相对于对照组样品目的基因的表达水平，-ΔΔCt=对照组ΔCt -各样品ΔCt，△Ct=目的△Ct-内参△Ct。每个样本重复3次然后进行统计分析。在网址http://www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl?terms=214中搜索miRNA-1、miRNA-133序列，在NCBI上搜索caspase-3、caspase-9基因的序列，primer5软件设计引物由上海生工合成。

2.3.3 Western blot 检测心肌组织caspase-3、caspase-9蛋白含量 剪取冻存心肌组织0.25 g,加入200 μlRIPA裂解液蛋白裂解，4 ℃12000rpm离心15 min，取上清分装离心管中；按照BCA蛋白定量试剂盒(Wellbio)使用说明操作，测定蛋白浓度。然后电泳、转膜、封闭、一抗孵育，用1×TBST将一抗按照一定比例稀释，caspase-3(1∶1000)，caspase-9(1∶200)，actin(1∶4000)，将膜与一抗一起孵育，4 ℃过夜。孵育结束，1×TBST洗3次，每次15 min，然后二抗孵育用1×TBST稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，稀释比例鼠抗(M)1∶4000，兔抗(R)1∶6000，将稀释后的二抗与膜共同孵育45～60 min。孵育结束，1×TBST洗3次，每次15 min。最后显色、曝光，使用ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3 min，用吸水纸吸尽液体，用保鲜膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光数秒至数分钟显影冲洗。将曝光后的底片扫描，并用quantity one专业灰度分析软件进行分析。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 心康冲剂对心肌细胞凋亡的作用

图1显示，直至药物干预8周结束时，除正常组无死亡外，其余各组均有大鼠死亡，其中模型组、对照组、心康高剂量组分别5只，心康低、中剂量组分别3只。400×光镜下，正常组心肌细胞核呈蓝色长梭形，排列规整。与正常组比较，模型组心肌细胞棕褐色坏死颗粒物质明显增多；与模型组比较，心康低、中、高剂量组心肌细胞棕褐色坏死颗粒物质明显减少；与对照组比较，心康低、中剂量组心肌细胞凋亡相对较少。心康冲剂低、中剂量组心肌细胞蓝色椭圆形细胞核与棕褐色颗粒物质并见，2组凋亡颗粒无明显差异。与心康低、中剂量组比较，心康高剂量组心肌细胞棕褐色坏死颗粒物质较多。

图1 TUNEL染色(心肌取材左心室横切面，400×光镜)

3.2 心康冲剂对心肌组织miRNA-1、miRNA-133及caspase-3 mRNA、caspase-9mRNA的作用

表2显示，与正常组比较，模型组miRNA-1、caspase-3mRNA、caspase-9mRNA表达显著增加，miRNA-133表达显著减少(P<0.05)；与模型组比较，心康低、中、高剂量3组miRNA-1、caspase-3mRNA、caspase-9mRNA表达显著下降，miRNA-133显著增加(P<0.05)；与对照组比较，心康高剂量miRNA-1、miRNA-133显著减少，caspase-9mRNA表达显著增加(P<0.05)；与心康低剂量比较，心康冲剂高剂量miRNA-1、miRNA-133显著减少，caspase-9mRNA表达显著增加(P<0.05)；与心康冲剂中剂量比较，心康冲剂高剂量miRNA-133显著减少，caspase-9mRNA表达显著增加(P<0.05)。

表2 各组大鼠心肌组织miRNA-1、miRNA-133及caspase-3 mRNA、caspase-9mRNA表达比较

注：与正常组比较:*P<0.05；与模型组比较:△P<0.05；与对照组比较:▲P<0.05；与心康低剂量组比较:▼P<0.05；与心康中剂量组比较:#P<0.05

3.3 心康冲剂对心肌组织caspase-3、caspase-9的蛋白作用

表3图2显示，与正常组比较，模型组caspase-3、caspase-9蛋白表达显著增加(P<0.05)；与模型组比较，心康冲剂低、中剂量组、对照组caspase-3、caspase-9蛋白表达显著下降(P<0.05)，心康高剂量组仅caspase-9蛋白表达显著下降(P<0.05)；与对照组比较，均无明显差异；与心康冲剂低剂量比较，仅心康冲剂高剂量caspase-3(17,19KD)蛋白表达增多(P<0.05)；与心康冲剂中剂量比较，仅心康冲剂高剂量caspase-3(17,19KD)蛋白表达增多(P<0.05)。

表3 各组大鼠心肌组织caspase-3、caspase-9蛋白表达比较

注：与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与对照组比较：▲P<0.05；与心康低剂量组比较：▼P<0.05；与心康中剂量组比较：#P<0.05

图2 Western blot法检测大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9蛋白表达比较

4 讨论

微小RNA(microRNA)几乎参与调控人类生长发育的各个阶段[12]。MiRNA-1、miRNA-133是心肌中特异性表达并可能参与凋亡调节过程[13]，但二者作用可能相反，表现在miRNA-1促进细胞凋亡[14]，而miRNA-133抑制心肌细胞凋亡[15]。Caspases是介导心肌细胞凋亡外源性途径和内源性途径的共同途径，两条通路最终都通过激活caspases介导心肌细胞凋亡并参与慢性心衰的发生发展，其中caspase-9处于凋亡上游，当被各种促凋亡因子激活后，对下游caspase产生作用，使其执行凋亡程序。Caspase-3是凋亡级联反应下游最关键的凋亡蛋白酶[16],它的激活是细胞凋亡的标志[17]，caspase-3是经典凋亡通路后期的共同途径。因此，下调caspase蛋白表达对于干预心室重构乃至心力衰竭具有重要意义[18]。MiRNA在调控caspase机制研究上也表现出相反的作用机制，如miRNA-133可能是靶向抑制caspase-9的表达，从而抑制心肌细胞凋亡[19-20]，而miRNA-1通过正性调控caspase-3促进细胞凋亡[21]。

本实验研究表明，心康冲剂干预后心肌凋亡减轻，尤其是心康冲剂低、中剂量组促凋亡分子miRNA-1、caspase-3及caspase-9的mRNA、蛋白表达显著下降，抗凋亡分子miRNA-133表达增加，与既往研究证实的在抑制心肌细胞凋亡中miRNA-133靶向抑制caspase-9、促进细胞凋亡中miRNA-1正性调控caspase-3的表达趋势相同。与对照组比较，心康冲剂低、中剂量组调控miRNA-1、miRNA-133、caspase-3、caspase-9表达无明显差异，但TUNNL染色仍显示心康冲剂低、中剂量组心肌凋亡相对少，表明心康冲剂低、中剂量可能通过其他途径增强抗心肌凋亡作用；与心康低、中剂量比较，心康冲剂高剂量在调控抗心肌凋亡基因和蛋白作用方面相对较弱。

慢性心衰早期主要以心气、心阳亏虚为主，中期为脾阳受损，复加肺气亏虚、水湿内停，后期肾阳虚衰，水饮泛滥。本实验研究表明，心康冲剂具有调控miRNA-1、miRNA-133/caspase-3、caspase-9抗心肌凋亡作用。MiRNA及其调控的靶基因在心血管疾病的病理过程中扮演着非常重要的角色，明确中药对miRNA及其靶基因的调控，寻找慢性心衰的药物治疗新靶点，阐明中药治疗慢性重大疾病的科学性，有利于提高中药在治疗慢性重病中的地位。