电刺激分离蚯蚓及其对蚯蚓体内生化指标的影响

王海候，孟祥国，金梅娟，施林林，周新伟，陆长婴，沈明星

(江苏太湖地区农业科学研究所 农业部苏州水稻土生态环境重点野外科学观测试验站，江苏 苏州 215155)

蚯蚓是一种以腐败有机物料为食的杂食性动物，在常温有氧条件下吞食有机物，通过肠道物理破碎及微生物的协同作用对有机固体废弃物进行生物氧化和转化，形成富含腐殖质和营养元素的蚓粪有机肥[1-2]。目前，利用蚯蚓处理有机废弃物已是一种新型的生态处理技术，蚯蚓生物消解技术已经广泛应用于畜禽粪便、城市污泥等有机固体废弃物的生物处置工程，有效实现了有机固体废弃物的资源化、减量化、无害化利用[3-7]。

现阶段我国蚯蚓处理生物有机废弃物技术比较成熟[8-12]，但是蚯蚓活体与蚓粪分离一直是蚯蚓处理废弃物能力提高的关键技术瓶颈，在一定程度上影响了蚯蚓处理有机废弃物潜力的发挥。分离蚯蚓活体与蚓粪的方法主要有人工法、光刺激法、滚轮振动法、诱捕法等[13-16]，但上述非人工辅助性方法成熟应用于生产实际的实例几乎没有。目前，蚯蚓处理有机废弃物的后期，蚯蚓活体与蚯蚓粪分离采收工作仍然以手工操作为主，效率低、劳动力成本高。作者所在项目组研究发现，采用电刺激的方法可以实现蚯蚓活体与蚓粪的快速分离(正申请专利保护)，并且可以显著提高劳动效率，降低劳动力投入成本，极大缓解了蚯蚓分离效率低下与有机废弃物处置压力大的矛盾。电刺激是否会造成蚯蚓生物机体组织损伤和功能障碍，也尚未可知。因此，本文拟研究应用电刺激方法分离蚯蚓与蚓粪过程中蚯蚓体内生化指标的变化，旨在为一种利用电刺激分离蚯蚓活体与蚓粪的技术可行性提供理论依据与数据支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试蚯蚓

选择具有成熟环、健康活泼的赤子爱胜蚓作为供试蚓种。蚯蚓鲜质量0.25～0.30 g·条-1、长约5 cm。

1.1.2 供试物料

选择蔬菜废弃物、牛粪、秸秆作为供试有机物料。蔬菜废弃物取自苏州市相城区望亭镇御亭现代农业园，主要为废弃的果、叶、根茎、藤蔓等混合鲜样，进行1～3 cm破碎(含水率84.7%、有机碳含量38.71%、全氮含量2.09%)；牛粪取自附近奶牛养殖场(含水率55.16%、有机碳含量34.07%、全氮含量1.12%)；秸秆取自附近农场的水稻秸秆，进行0.2～0.5 cm粉碎(含水率20.19%、有机碳含量44.51%、全氮含量0.71%)。试验首先堆制总重约1 000 kg，碳氮比约为25的蔬菜废弃物混合堆肥体，将800 kg新鲜蔬菜废弃物与100 kg牛粪、100 kg秸秆粉末充分混合，控制水分65%～75%，堆成垛状并覆盖薄膜，进行好氧堆制腐解10～14 d，备用。

1.2 处理设计

试验于2018年10月在江苏太湖地区农业科学研究所实验室内进行。围绕蚯蚓与蚯蚓粪快速分离的目标，项目组研发了一种利用电刺激分离蚯蚓的方法及装置(正申请专利保护)。本试验主要应用电刺激分离蚯蚓的方法及装置，进行蚯蚓分离效果比较，以及蚯蚓生理生化指标对电刺激的响应。

1.2.1 电刺激分离蚯蚓、蚓粪的效果

以人工分离蚯蚓为对照，以电刺激分离蚯蚓为处理，每个处理各5次重复。取半腐解处理的有机物料100 kg，分别装入2个相同大小的塑料整理箱(120 cm×50 cm×28 cm)中，每个整理箱的有机物料为50 kg，每箱投入蚯蚓2.5 kg，控制水分60%左右，置于避光阴凉处，培养21 d。培养结束后，将蚯蚓连同蚯蚓粪一起取出，分成10份，每份5 kg。其中5份分别装入蚯蚓电刺激分离装置，进行电刺激分离作业，另外5份分别置于塑料纸上，选用熟练工进行人工分离蚯蚓作业。每个处理的分离作业时间均为30 min，记录第30 min时蚯蚓的分离数量，其余的蚯蚓均采用人工分离，记录剩余的蚯蚓数量(包括成蚓、幼蚓及蚓茧数量)。

1.2.2 电刺激对蚯蚓生理生化指标的影响

以试验1为基础，共设3个处理，分别采集未电刺激分离的蚯蚓、电刺激分离的蚯蚓、电刺激分离后再恢复培养5 d的蚯蚓。其中，未电刺激分离的蚯蚓取试验1中人工分离处理的蚯蚓，每个重复取50 g，待测；电刺激分离的蚯蚓取试验1中经历电刺激(电流10 mA、刺激时间30 min)的蚯蚓，每个重复取100 g，平均分成2份，1份待测，1份置于有机物料中继续进行恢复性培养5 d，再通过人工分离待测。每个处理重复5次，上述待测样品先用超纯水洗净表面有机物料后，放入底部铺有湿润滤纸的2 L烧杯中，用无纺布封口，置于25 ℃人工气候箱中，避光培养8 h，用于除尽蚯蚓肠道内杂物等。最后置于-86 ℃超低温冰箱保存待测。

1.3 指标检测

1.3.1 蚯蚓分离效率

蚯蚓数包括了成蚓、幼蚓及蚓茧数量，指30 min内分离的蚯蚓数占蚯蚓总数的比例。

1.3.2 蛋白含量及酶活力或含量的测定

蚯蚓样品的蛋白含量及酶活力或含量测定，由南京钟鼎生物技术有限公司测定完成。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法测定，过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、纤维素酶的活性、丙二醛(MDA)含量采用试剂盒法测定[17-18]。

1.4 数据处理

蚯蚓分离效率、蚯蚓体内生化指标由5组蚯蚓试验样本的平均值得到。数据采用Excel 2010进行数据整理与画图，SPSS 23.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 电刺激对蚯蚓、蚓粪分离效果的影响

电刺激分离蚯蚓过程主要是将蚯蚓连同消解物料一起装入生物反应器内，待物料消解结束后，应用10 mA弱电流间歇式刺激30 min，蚯蚓在电刺激下逃离生物反应器，从而实现蚯蚓与蚓粪的分离。由图1可知，在相同蚯蚓物料体质量、相同分离时间条件下，电刺激分离的蚯蚓分离率显著大于人工方式，分离率提高了31.9百分点。

柱间无相同小写字母表示处理间差异显著(表3～5同)。图1 不同分离方式对蚯蚓、蚓粪分离率的影响

电刺激处理的蚯蚓分离率随着电刺激时间的增加呈上升趋势(图2)。蚯蚓分离率与电刺激时间呈极显著性线性正相关，y=2.596x+10.115(r=0.997**)，说明分离率0～84.6%时，电刺激时间每增加1 min，蚯蚓分离率可提高2.6百分点。与人工分离方式相比，在蚯蚓应用于农业废弃物循环消解工程中，当蚯蚓密度较高时，可以通过电刺激方式，实现蚯蚓密度的有效降低。

图2 不同电刺激时间对蚯蚓、蚓粪分离率的影响

2.2 电刺激对蚯蚓体内生化指标的影响

2.2.1 可溶性蛋白、MDA含量

蚯蚓在逆境胁迫条件下，机体功能和内分泌系统受损，在短期内会产生较多的应激蛋白去应对逆境胁迫负荷，从而引起体内蛋白含量的升高[19-20]。如图3所示，与对照相比，电刺激及电刺激5 d后的蚯蚓体内可溶性蛋白含量均无显著性差异，说明10 mA弱电流间歇式刺激30 min后，对蚯蚓体内可溶性蛋白含量无显著影响。MDA作为膜脂质过氧化物的产物，是细胞膜脂质过氧化程度及应激反应强弱的重要指示指标，MDA含量与机体损伤呈正比[21]。研究发现，电刺激显著提高了蚯蚓体内MDA含量，但电刺激后培养5 d，蚯蚓体内MDA含量与对照无显著性差异。

图3 电刺激对蚯蚓可溶性蛋白及MDA含量的影响

2.2.2 SOD、CAT活性

生物体内活性氧的消除主要是由抗氧化防御系统酶来完成，抗氧化防御系统酶主要有SOD、CAT、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、细胞色素过氧化物酶、NADH过氢化酶与氧化酶等，其中研究最多的是SOD、CAT[22]。SOD是消除细胞体内生物氧化、产生超氧阴离子自由基的金属酶类，是生物体内重要的氧自由基消除剂[23]。如图4所示，各处理组蚯蚓体内SOD、CAT活性物无显著性差异。

图4 电刺激对蚯蚓SOD、CAT活性的影响

2.2.3 纤维素酶、AchE活性

蚯蚓作为一种植食性动物，是有机物质的分解者，蚯蚓体内的纤维素酶对土壤中有机物质的分解起着重要作用，纤维素酶活性越高，消解能力越强[24]。AchE在蚯蚓的神经传递过程中起着重要作用，AchE活性主要用于评价逆境因子对蚯蚓的胁迫情况，AchE活性越低，则蚯蚓神经传递受阻，生命力则越差[25]。图5所示，电刺激后蚯蚓体内纤维素酶活性与对照组无显著性差异；继续培养5 d后，蚯蚓体内的纤维素酶活性显著高于对照组和电刺激组。各处理组蚯蚓AchE活性均无显著性差异。

图5 电刺激对蚯蚓纤维素酶、AchE活性的影响

3 讨论

与对照处理相比，在相同物料体质量、相同分离时间下，电刺激处理的蚯蚓分离率显著提高了31.9百分点。电刺激处理下蚯蚓分离率可达84.6%，且分离率0～84.6%时，电刺激时间每增加1 min，蚯蚓分离率可提高2.6百分点。蚯蚓在弱电流刺激及间隙式电场作用下分离，可能与蚯蚓在电刺激胁迫下产生不适感而应激逃跑，实现蚯蚓与蚓粪的分离，但有关电刺激措施对蚯蚓的负荷方式、作用机制等均尚不清楚，有待于进一步的研究。

随着分子生物学技术的发展，环境逆境胁迫对蚯蚓生化指标影响的研究已经成为蚯蚓生态毒理学的研究热点，利用蚯蚓的分子、生物化学和生理反应，即生物标志物指示逆境胁迫对蚯蚓所产生的影响，并作为早期应对逆境胁迫的预警监测指标[26]。本试验关注了蚯蚓经电刺激处理后可溶性蛋白、MDA、纤维素酶、CAT、SOD、AchE等生化指标的变化情况，发现蚯蚓对电刺激胁迫具有耐受性，且影响在蚯蚓后期的培养中可以实现自我恢复[19-20]。另外，电刺激后培养5 d的蚯蚓体内纤维素酶活性仍显著高于对照，说明电刺激对蚯蚓机体功能及内分泌的影响只是短暂的，并不影响其持续的生长与消解能力，有关电刺激处理后纤维素酶活性的促进作用原因，尚有待进一步研究。