曝二氧化碳气体对近具刺链带藻在高氨氮废水中生长的影响

罗龙皂，林小爱，朱 峰，曾凡健，张邦喜，刘 烨，田光明，*

(1.上饶师范学院 化学与环境科学学院，江西 上饶 334001；2.浙江大学 环境与资源学院，浙江 杭州 310058；3.上饶师范学院 生命科学学院，江西 上饶 334001；4.贵州省农业资源与环境研究所，贵州 贵阳 550006)

微藻是一类光合作用效率很高的初级生产者，其利用太阳能固定CO2的效率是其他陆生植物的10～50倍[1]。同时，微藻具有不与粮争地、生长周期短、生长速度快，以及油脂含量高等特点，可作为生产生物质能的理想原材料[2]。然而，微藻培养过程中需要吸收大量的养分，成本较高。近年来，很多学者尝试采用各种废水来培养微藻，既收获了微藻，又使水质得到了净化[3-7]。各种废水中，养猪废水因氮、磷丰富，可为微藻生长提供充足的养分来源。

养猪废水中的氮素主要为氨氮。氨氮是大多数微藻优先利用的氮素形式[8]，但是当废水中的氨氮浓度超过微藻耐受范围时，会对微藻生长产生抑制作用，严重时甚至导致藻体死亡[9-12]。养猪废水中氨氮的质量浓度很高，从几百毫克每升到上千毫克每升不等[13]，直接用其培养微藻并不可行；因此，利用养猪废水培养微藻前，须对其进行预处理。目前，主要的预处理方法包括厌氧发酵[6-7]和稀释[7，14]。厌氧发酵法只能降低养猪废水中的有机物含量[15]，对氨氮的去除效果不显著[16]；稀释法虽然可以降低废水中的养分含量[17]，但需消耗大量的水资源，增加了培养成本。因此，有必要寻找一种经济有效的养猪废水预处理方法。

本文选取对养猪废水净化效果好的近具刺链带藻作为研究对象，考查其在不同质量浓度氨氮废水中的生长情况，探讨曝二氧化碳气体对提高微藻在高质量浓度氨氮废水中生长能力的效果，旨在为实现养猪废水规模化培养微藻的资源化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 藻种及培养条件

本试验所用的近具刺链带藻(Desmodesmussp. CHXl)由本课题组从养猪废水中分离获得[21]。收集处于对数期的藻细胞，经1 μm醋酸纤维滤膜(上海新亚)过滤后，用超纯水洗净再次过滤。使用带针头的注射器抽取一定体积的模拟废水将滤膜上的微藻冲洗至500 mL锥形瓶中，记录冲洗所用的模拟废水体积，继续向锥形瓶中加入模拟废水，使锥形瓶中的模拟废水总体积为400 mL。

所用的模拟废水在BG11培养基的基础上改进配制而成，即将BG11中的硝酸钠替换为硫酸铵，且硫酸铵在不同处理下的用量不同，以确保达到设定的初始氨氮质量浓度，其他成分的质量浓度(mg·L-1)如下：K2HPO4·3H2O 40，MgSO4·7H2O 75，Fe(NH4)3C18H10O146，CaCl2·2H2O 36，Na2CO320，柠檬酸6，Na2-EDTA 1，另加入A5溶液 1 mL·L-1。A5溶液组成：H3BO32.86 g，MnCl2·4H2O 1.81 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.079 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.39 g，Co(NO3)2·6H2O 0.049 g，加双蒸水至1 000 mL。

参照文献[22]设置适合近具刺链带藻生长的条件：每天24 h全光照，光照强度为7 000 lx，温度30 ℃。将所有试验锥形瓶放置在光照培养箱中，按照上述条件进行培养。锥形瓶底部设有磁力搅拌器，搅拌速率为1 000 r·min-1。

1.2 试验设计

1.2.1 不同质量浓度氨氮废水对微藻生长的影响

由于养猪废水中的氨氮质量浓度一般在200～1 000 mg·L-1[13]，故本文配制的5种废水的初始氨氮质量浓度分别为350 mg·L-1(T1)、450 mg·L-1(T2)、600 mg·L-1(T3)、750 mg·L-1(T4)、900 mg·L-1(T5)[废水中的各种成分详见1.1节，其中，(NH4)2SO4在T1～T5处理中的质量浓度分别为1.65、2.12、2.83、3.54、4.24 g·L-1)，并用HCl或NaOH溶液调节废水初始pH值到8.00，每个处理设置3个重复。分别向各个处理接种处于对数期的藻细胞，控制藻细胞质量浓度在0.10 g·L-1左右(D690≈0.12)。每天对微藻生长情况和水质进行监测。

1.2.2 曝二氧化碳气体对微藻生长的影响

根据文献调研结果，当废水中的游离氨质量浓度足够低时(如1.0 mg·L-1)，其基本不会对微藻产生毒害作用。根据Yamamoto等[23]有关游离氨和氨氮质量浓度、温度及pH的计算公式，计算出30 ℃条件下含不同初始质量浓度氨氮废水中当游离氨质量浓度达到1.0 mg·L-1时所对应的pH值。向含不同质量浓度氨氮的废水中通入二氧化碳气体(流速为20 mL·min-1)，直至将其pH调至表1中指定值为止，曝气过程结束。随后向经二氧化碳曝气预处理的废水中接种处于对数期的藻细胞，控制藻细胞质量浓度在0.1 g·L-1左右(D690≈0.12)。每天对微藻生长情况和水质进行监测。

表1 将各处理游离氨质量浓度调至1.0mg·L-1时对应的pH值及二氧化碳曝气时间

Table1Corresponding aeration time for regulating ammonia concentration to 1.0 mg·L-1of different treatments

处理Treatment初始氨氮质量浓度Initial ammoniumconcentration/(mg·L-1)pH曝气时间Aerationtime/minR13506.541.55R24506.252.33R36006.062.83R47505.923.77R59005.815.35

1.3 分析项目及方法

废水中氨氮的质量浓度采用纳氏试剂法测定，废水的pH值用pH计(HACH，PHS-3B型，美国)测定。微藻生物量采用分光光度法测定，在690 nm处测定D690，并按文献[21]中的公式计算生物量。测定藻液吸光度时，以未接种微藻的模拟废水作为对照，以扣除养猪废水中悬浮物对藻液吸光度的影响。藻体氮含量参照测定植株全氮含量的相关方法进行。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2013和SPSS 20.0软件对数据进行整理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度氨氮废水中微藻的生长情况

近具刺链带藻在5种质量浓度的氨氮废水中，生长均受到明显抑制(图1-A)。刚接种的微藻处于对数期，具有较强的活力，但由于废水中氨氮质量浓度过高，其生长受到抑制，因此生物量在2～5 d无明显增加。随着微藻对环境的适应及废水中游离氨质量浓度降低，微藻生物量从第6天起开始增加。除第1天外，T1处理下微藻的生物量始终显著(P<0.05)高于其他处理。从第6天开始，微藻生物量随着初始氨氮质量浓度增加呈下降趋势；到第7天时，各处理的微藻生物量由高到低依次为T1>T2>T3>T4>T5，且不同处理间差异显著。

氨氮废水中对微藻产生抑制作用的主要是游离氨[18]，它可以直接穿透细胞膜，对微藻光合系统产生毒害作用[18-19]。研究表明，当游离氨的质量浓度高于30.00 mg·L-1时，会对绿藻生长产生抑制作用[24]。微藻接种前，T1～T5处理的游离氨质量浓度分别为32.91、49.59、67.88、83.44、101.82 mg·L-1(图2-A)，均高于微藻生长的耐受阈值，因此各处理下微藻的生长均受到抑制。初始氨氮质量浓度越低，废水中的游离氨浓度越低，微藻生长受到的抑制程度越低，因此T1处理下微藻的生长情况好于其他处理。

相同时间柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters in the same time indicated significant difference at P<0.05. The same as below.图1 微藻在不同质量浓度氨氮废水中的生长情况Fig.1 Growth of Desmodesmus sp. CHX1 in the wastewater with different ammonium concentrations

图2 不同处理下废水中的游离氨质量浓度变化Fig.2 Variation of ammonia concentration in wastewater under different treatments

2.2 二氧化碳曝气条件下微藻的生长情况

对含不同质量浓度的氨氮废水进行曝二氧化碳气体处理后，各处理废水的pH值从8.00降至5.81～6.54，初始游离氨质量浓度降至1.00 mg·L-1，明显低于未曝气处理(图2)，因而微藻的生长情况也明显优于未曝气处理(图1)。培养7 d后，各处理的生物量增加0.32～0.47 g·L-1，较未曝气处理提高0.09～0.26 g·L-1，且增加幅度随废水中初始氨氮质量浓度升高而变大。与未曝气相比，经二氧化碳曝气的各处理的微藻生物量有着相同的变化趋势，即接种1 d后增长较快，随后增长速度放缓。这是因为第2天后废水的pH值升高，导致游离氨浓度上升(图2-B)，微藻生长受到抑制。此外，曝气处理后微藻生物量随初始氨氮质量浓度增加而增加。这有可能是因为当曝气处理将废水中的游离氨质量浓度限制在较低水平时，铵盐质量浓度越高，越有利于微藻的生长。为了证实这一推断，将微藻生物量与氨氮质量浓度进行相关性分析。结果表明，曝气条件下二者呈显著(P<0.05)正相关关系，即氨氮质量浓度越高，微藻生物量越大；但未曝气条件下微藻生物量与氨氮质量浓度则呈显著的负相关关系(图3)。由此可见，二氧化碳曝气预处理可以改善微藻在高质量浓度氨氮废水中的生长情况。原因是：一方面，曝二氧化碳气体降低了废水的pH值，使得游离氨的质量浓度降低；另一方面，曝二氧化碳气体增加了废水中的碳源供给，有助于提高微藻的生物量[25]。

2.3 不同处理下废水的pH值变化

图3 曝气与未曝气条件下微藻生物量与氨氮质量浓度的关系Fig.3 Relationship between microalgae biomass and ammonium concentration under both with or without aeration conditions

2.4 不同处理废水中的氨氮去除率

对微藻培养过程中各处理的氨氮质量浓度进行监测，结果表明，各处理的氨氮质量浓度均呈缓慢下降趋势。培养7 d后，各处理的氨氮去除率在3.76%～20.10%(表2)，以R1处理最高，且显著(P<0.05)高于其他处理。各处理的氨氮去除速率在3.52～25.48 mg·L-1·d-1，以T5处理最高，且显著(P<0.05)高于其他处理。对比可见，当废水中的初始氨氮质量浓度<600 mg·L-1时，曝气处理的氨氮去除效率显著(P<0.05)高于未曝气处理；但当废水中的初始氨氮质量浓度≥600 mg·L-1时，曝气处理的氨氮去除效果并不优于未曝气处理。废水中的氨氮主要通过氨挥发和微藻吸收等形式被去除[28]，其中，微藻吸收仅占氨氮去除的很小一部分，废水中的氨氮主要通过氨挥发等途径得以去除，该部分所占比例高达99%以上。该结果与前人研究一致[29]。

3 结论

近具刺链带藻在初始氨氮质量浓度为350～900 mg L-1的废水中生长受到明显抑制。向废水中曝二氧化碳气体可以降低废水pH值，从而减少废水中的游离氨对微藻生长的抑制。在未曝二氧化碳气体的情况下，若利用氨氮作为唯一氮源培养微藻，废水中的pH值下降；而曝气处理下，废水中的pH值呈先升高后降低趋势。在本试验条件下，废水中氨氮的去除率在3.76%～20.10%。

R1～R5处理第1天的pH值见表1，因均低于7.0，故在图中未给出。The pH values of R1-R5 (seen in Table 1) were smaller than 7.0， so they were not shown in the above figure.图4 不同条件下各处理的废水pH值变化Fig.4 Variation of pH in the wastewater under different treatments

表2 废水中氨氮的去除情况与途径

Table2Removal efficiency and ways of ammonium in wastewater

处理Treatment去除率Removalefficiency/%去除速率Removal rate/(mg·L-1·d-1)各途径的去除比例Contribution of different removal ways/%微藻吸收Assimilation by microalgae氨损失Ammonia lossT117.37±0.28 b10.13±0.19 d0.00399.997T24.69±0.54 e3.52±0.46 e0.01499.986T34.55±0.16 e4.55±0.43 e0.00599.995T49.92±0.26 d12.40±0.32 c0.00499.996T516.98±1.50 b25.48±2.25 a0.00299.998R120.10±0.56 a11.72±0.96 cd0.01499.986R214.69±0.64 c11.01±0.48 cd0.00799.993R33.76±0.31 e3.76±0.57 e0.04199.959R48.76±0.06 d10.98±0.08 cd0.01199.989R510.02±0.11 d15.03±0.16 b0.01699.984

同列数据后无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。

Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05.