四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析

易可可，阴文奇，周远成，蒋金蓁，张白玉，李中银，颜其贵，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；3.四川华神兽用生物制品有限公司，四川 成都 610200；4.四川伊禾动物药品有限公司，四川 成都 610066)

猪伪狂犬病(porcine pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)引起的一种由疱疹病毒感染的高度接触性传染病[1-2]，能引起猪发热、奇痒、繁殖障碍、脑脊髓炎等症状。PRV能感染反刍动物、啮齿动物、食肉动物等哺乳动物和鸟类，有高致病率[3-5]，但猪是PRV唯一的传播和贮存宿主[6]，能隐性感染，长期带毒，曾经给欧洲和美洲带来巨大经济影响[7-10]。PRV主要侵害猪神经系统及生殖系统，各个阶段猪只均可感染，可引起妊娠母猪繁殖障碍病毒终身潜伏、流产、产死胎和呼吸道症状；新生仔猪出现神经症状、腹泻、呕吐、生长不良等表现，死亡率极高[11]，一旦感染该病，难以清除[12]，其传播速度快、范围广、途径多，国际动物卫生组织(OIE)已将其列为二类传染病[6]。20世纪gE基因缺失的Bartha-K61疫苗传入中国，从90年代开始广泛应用于我国的各大猪场，使PRV得到了有效的控制[13]。2011年以来，许多接种了Bartha-K61疫苗的猪场大规模暴发PRV，对我国养猪业和农业经济造成了巨大损失，通过近年来的分离毒株分析，PRV变异是暴发伪狂犬病的最主要原因[14-15]。由此可见，Bartha-K61疫苗不能对变异PRV毒株起到全面和有效保护作用[16]。

本实验从2016—2017年疑似感染伪狂犬病的猪病料中分离出4株PRV毒株，通过生物学特性研究分析，并收集2011年至今的主要变异毒株和国内外经典毒株进行毒力基因gB、gC、gE和TK序列比对，进行同源性测定并构建进化树，分析变异株的基因间差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料与实验动物

从福建和四川某猪场疑似PRV感染仔猪中分别采集脑、扁桃体、肺脏、脾脏等组织，-20 ℃保存备用。6周龄Balb/c小白鼠购于成都达硕实验动物有限公司。

1.1.2 主要试剂

DMEM细胞培养液、胰酶购自Hyclone公司，胎牛血清购自AusGeneX公司；LATaq聚合酶、T4 DNA连接酶、pMD18-T载体、GC Buffer、dNTP、大肠埃希菌DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；血液/组织/细胞基因组提取试剂盒购自TIANGEN生化科技有限公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；猪肾细胞(PK-15细胞)由四川农业大学微生物与免疫实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 病猪的病理解剖与病料处理

对采集的病猪病变组织进行研磨，加入适量PBS制成匀浆，反复冻融3次，10 000g离心5 min，将上清液分装置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成

根据GenBank中发表的PRVgB、gC、gE、TK(登录号为KM189912.1)全基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计gE检测引物和4对引物扩增该4个基因的全长，引物序列见表1，引物由成都擎科有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA的提取

对采集的组织病料提取DNA，使用TIANGEN的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，具体操作参照试剂盒说明书。

1.2.4 病料PCR鉴定

以提取的病料DNA作为模板，反应体系为25 μL，LATaq酶0.25 μL，2×GC Buffer Ⅰ/Ⅱ 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，dNTP 1 μL，灭菌去离子水补足25 μL。鉴定PRVgE基因反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，61.4 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，温度降至4 ℃，加入2.5 μL 10×Loading Buffer终止反应；取10.0 μL PCR产物加入1.0%琼脂糖胶孔中电泳，于凝胶成像系统下观察结果并拍照。

表1 引物序列信息

Table1Primer sequence information

引物名称Primer name引物序列Sequence(5′-3′)长度Length/bp退火温度Annealing temperature/℃GC Buffer引物用途UsagePgE-FACCTGAGCGTCCTGCGG55361.4Buffer Ⅰ鉴定PRV Identification of PRVPgE-RCCGTTGTGGGTCATCACGAGgB-FTCTTCAGGTCCGTCTTCCAC287751.0Buffer ⅡgB基因 gB genegB-RAACGGCATCTTTATTTTTTTCCATCTgC-FTGTGTGCCACTAGCATTAAATCCG170255.0Buffer ⅠgC基因gC genegC-RGAGAGGAGAGTGGAGTGGGACgE-FGCCACCATCGCAGAAGAACAA205756.0Buffer ⅡgE基因gE genegE-RTCTCGCTGTAGTAGCAGTCCGTK-FATGCGCATCCTCCGGATCTACCTCG96362.0Buffer ⅠTK基因TK geneTK-RTCACACCCCCATCTCCGACGTGAAG

1.2.5 病毒分离培养

将PCR鉴定为阳性的PRV病料处理成悬液，4 ℃ 4 000 r·min-1离心10 min，取上清液用0.22 μm过滤器过滤后，加适量双抗孵育过夜，保存至-20 ℃。待PK-15细胞长成单层铺至80%时，取1 mL滤液接种细胞，轻轻混匀，37 ℃ 5% CO2培养箱中放置1 h，倒去滤液加入2% DMEM维持液，同时设立对照细胞组，每天观察细胞状况，并记录病变情况，待病变达到70%时收毒，盲传5代后进行PCR鉴定。

1.2.6 病毒TCID50测定

将收集的病毒液反复冻融3次，12 000 r·min-1离心1 min，取上清液。PK-15细胞在96孔中培养至单层，将分离的病毒液用DMEM培养液按10倍梯度稀释，从10-1～10-10，按照每个稀释度分别加1列8孔，每孔加入100 μL，最后两列只加入DMEM培养液作阴性对照，置于细胞培养箱放1 h后吸去每孔中的液体，用PBS洗两次后加入100 μL 2% DMEM培养液，继续培养，72 h后开始观察并每天记录病变孔数情况，按Reed-Muench法计算病毒TCID50。

1.2.7 小鼠LD50测定

每株准备50只6周龄雌性SPF级Balb/c小鼠，随机分成5组，每组10只。将病毒10倍梯度稀释成104～100TCID50s，每个稀释度一组，接种0.1 mL于小鼠大腿肌肉；同时设立一组空白对照，相同剂量和部位注射DMEM培养液，在相同条件下隔离饲养。每6 h观察并记录小鼠精神状况、临床症状和死亡时间，结果根据Reed-Muench法计算病毒对Balb/c小鼠的半数致死量(LD50)。

1.2.8gB、gC、gE和TK全基因测序

病毒液抽提DNA后作为模板，反应体系为50 μL，LATaq酶0.5 μL，2×GC Buffer Ⅰ/Ⅱ 25 μL，上下游引物各2 μL，模板2 μL，dNTP 4 μL(根据目的条带长度添加，每1 000 bp添加1 μL)，灭菌去离子水补足50 μL。94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，51 ℃(根据不同引物选择退火温度)1 min，72 ℃ 1 min(根据目的条带大小选择，每1 000 bp延长1 min)，35个循环；72 ℃延伸10 min，温度降至4 ℃，PCR产物加入1.0%琼脂糖胶孔中电泳，回收目的片段，连接pMD18-T载体转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，在LB氨苄固体培养基上筛选出阳性菌后，提取质粒，送往成都擎科生物有限公司测序。

1.2.9 毒力基因全基因序列分析

参考多株国内外经典和变异PRV毒株，利用Mega7.0和MegAlign软件将测序结果的gB、gC、gE和TK基因序列进行对比和建立进化树。

2 结果与分析

2.1 PRV的分离鉴定

2.1.1 病理剖检结果

患病仔猪剖检后发现所有仔猪均出现脑出血，扁桃体坏死，肺脏和肾脏有出血点，肝脏和肺脏表面有白色坏死灶等症状。

2.1.2 病料检测结果

病料组织进行gE基因PCR扩增后，在检测的脑部、扁桃体、肾脏、肺脏等均扩增出553 bp的目的条带。

2.1.3 病毒的分离

处理的组织悬液接种到长满单层的PK-15细胞上，第1代均出现病变，盲传几代后时间和CPE稳定，接毒后24 h后细胞变圆变亮，聚集，拉网并形成合胞体(图1-A)，而对照组没有病变(图1-B)。

2.1.4 病毒液的PCR鉴定

对病毒液提取的核酸进行PRVgEPCR鉴定，结果能扩增出目的条带(图2)。

2.1.5 病毒滴度测定

病毒在PK-15细胞上传第1代和第5代的都收毒进行滴度测定，按照Reed-Muench法计算PRV的滴度，单位为每0.1 mL病毒液中含多少TCID50s的病毒粒子，结果如表2。

2.1.6 小鼠LD50测定

PRV FJ01株、FJ03株、YK株和MS2018株分别攻毒Balb/c小鼠后，临床症状为局部严重瘙痒、呼吸急促、被毛蓬乱、频繁舔咬注射部位并裸露出皮肤，死亡时间平均为54～96 h，高剂量小鼠全部死亡，对照组小鼠精神状态正常。PRV各毒株对Balb/c小鼠的半数致死量LD50分别为102.17、102.72、103.44、103.51TCID50s(表3)。

A，PRV感染细胞；B，正常细胞对照。A， Virus infected cell; B， Normal cell control.图1 病料悬液上清液感染PK-15细胞病变图(100×)Fig.1 Cytopathic effect of PK-15 cells infected by epidemic tissue suspension supernatant (100×)

表2 不同代次PRV毒株滴度测定

Table2Titers identification of different passage PRV strains

毒株Strain滴度Titers/(TCID50s·0.1 mL-1)F1F5FJ0110-6.310-6.63FJ0310-6.610-7.08YK10-7.710-8.10MS201810-6.710-7.18

2.2 PRV分离株的gB、gC、gE和TK基因的序列分析

2.2.1gB基因

PRV FJ01株、PRV FJ03株、PRV YK株和PRV MS2018株的gB基因核苷酸序列与2011年以来国内流行的PRV变异株HNB、ZJ01、JS-2012、TJ株等的同源性为98.5%～100%，与疫苗株Ea、Fa和Bartha株同源性为98.2%～99.8%，与国内外PRV经典毒株Kaplan、Kolchis、NIA3、Becker等同源性为97.7%～99.6%；4个分离PRV毒株的gB基因编码的氨基酸与近年流行的变异株同源性为97.0%～100%，与疫苗株同源性为96.3%～99.7%，与经典毒株同源性为95.3%～99.1%。PRV FJ01、FJ03和MS2018株在进化树上与近几年国内分离的PRV变异株HN1201、HNX、HNB等在同一大分支；YK株与国外经典毒株亲缘性更近(图3-A)。

表3PRV毒株对Bablb/c小鼠LD50测定

Table3LD50measurement of PRV strains on Balb/c mice

毒株Strain分组Group感染剂量Dose/TCID50s小鼠数量Mice number死亡数Mortality存活数Survival number半数致死量LD50/TCID50sFJ01A410410100102.17A310310100A21021046A110110010A010010010FJ03B41041091102.72B31031073B21021019B110110010B010010010MS2018C41041073103.51C31031028C21021019C110110010C010010010YKD41041082103.44D31031028D21021019D110110010D010010010对照组ControlEPK1510010—

“—”表示无数据。

“—” represented no data.

图3 PRV分离株gB、gC基因的核苷酸遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree of PRV gB and gC gene between PRV strains and other reference strains

2.2.2gC基因

PRV FJ01株、FJ03株和MS2018株gC基因的核苷酸序列与近年流行变异PRV株同源性为91.8%～99.9%，与Ea、Fa、Bartha和SA215疫苗株同源性为91.9%～99.9%，与国内外经典毒株同源性为89.3%～98.7%，同源性较低；gC基因编码的氨基酸与变异毒株，除YK株外同源性为97.0%～100%，YK株为89.5%～89.7%，同源性较低；与PRV疫苗株同源性为88.4%～99.4%，与国内外经典毒株同源性为86.0%～96.9%。在进化分支上，PRV FJ01株、FJ03株、MS2018株与国内毒株亲缘性更近，与近年的变异株在同一大进化分支上，而YK株与国外经典毒株在同一进化分支上，与国内毒株亲缘性远(图3-B)。

2.2.3gE基因

PRV FJ01株、F0J3株和MS2018株gE基因的核苷酸序列与近年流行变异PRV株同源性为95.9%～99.5%，与Ea、Fa、Bartha疫苗株的同源性为96.4%～99.5%，与Kaplan、Becker、Kolchis、Hercules等国外经典毒株同源性为96.1%～98.8%；gE基因编码的氨基酸与近年变异PRV株同源性为90.6%～100%；与疫苗毒株同源性为95.8%～99.4%，与国外经典毒株同源性为95.6%～100%。FJ01株、FJ03株、MS2018株在进化树上与国内2011年后分离出的PRV毒株如HNX株、HLJ8株、HB1201株、HN1201株等在同一大进化分支上，与疫苗毒株和国内外经典毒株亲缘性较远；YK株与国外经典毒株在同一进化分支上，亲缘性较近(图4-A)。

2.2.4TK基因

4个分离PRV毒株的TK基因核苷酸序列与国内近几年流行分离HNX、JS-1201、HB1201、BJ/YT等变异毒株同源性为98.4%～100%，与Bartha、Fa、Ea等疫苗株同源性为98.6%～100%，与国外经典毒株Kaplan、Becker等同源性在97.9%～99.7%，各毒株间遗传变异不大，同源性都很高，说明TK基因较为保守。TK编码的氨基酸序列与近年变异株同源性为99.7%～100%，与疫苗株同源性为99.0%～99.9%，与国外经典毒株同源性为98.3%～99.9%，同源性较高。FJ01株、FJ03株与MS2018株的TK基因序列在进化树上与国内分离的各PRV毒株在同一进化分支上，与国内毒株亲缘性较近；YK株的TK基因与国内和国外均亲缘性较远，在单独一个分支上(图4-B)。

3 讨论

自2011年以来，中国许多地区免疫过Bartha-K61疫苗的猪场大规模暴发PRV[17]，且在国内广泛流行，有研究已经确定了是由PRV变异毒株引起[18]，意味着Bartha-K61疫苗已不能全面提供保护[19]，疑似暴发PRV猪场的猪表现为高烧、严重呼吸道疾病、厌食、震颤等精神症状[18]。本研究对各地猪场有疑似PRV的病料进行抗原检测和病毒分离，得到4株PRV病毒，初步鉴定为野毒感染，并深入研究是否为变异毒株以及生物学特性探究。

图4 PRV分离株gE、TK基因的核苷酸遗传进化树Fig.4 Phylogenetic tree of PRV gE and TK gene between PRV strains and other reference strains

本实验采用猪肾PK-15细胞分离病毒，4个病毒分别命名为PRV FJ01株、PRV FJ03株、PRV YK株和PRV MS2018株。将病毒盲传至5代，同时与第一代病毒做TCID50，发现滴度随着代数增多而增加。用第5代毒攻毒Balb/c小鼠计算半数致死量，毒力最强的毒株为PRV FJ01株，LD50为102.17TCID50s·0.1mL-1，而我国在2011年前就分离得到的Fa、Ea和S经典毒株LD50分别是100.7、102.0和103.83TCID50s，2011年后分离出的HNX、HNB、TJ、HeN1和JS-2012株的LD50分别为102.0、102.4、102.3、102.37和102.37TCID50s，可以看出Fa毒力是最高的，由此可以得知，中国变异株的毒力没有增强，猪群暴发伪狂犬病且高死亡率与毒力增强无关，但从小鼠实验结果可以发现，变异株能让小鼠产生更为严重的瘙痒症状。

gB是PRV必需糖蛋白，也是主要的免疫相关蛋白，是最保守的蛋白之一，是病毒感染所必需的，与病毒入侵细胞和在细胞间传播密切相关[20]，产生中和病毒的抗体[21]。gC参与病毒入侵细胞过程，是PRV最主要的保护性抗原之一，能诱导细胞免疫，产生中和抗体[19]，gB和gC的变异性，是伪狂犬病毒的特征；gE不是病毒复制必需的蛋白，但它是主要的毒力因子之一，呈现出嗜神经性，在病毒释放与传播中使PRV接触临近的神经元，从而进入中枢神经系统，促进病毒在内转运和扩散[22]，有研究表明，gE缺失株与其他蛋白缺失株相比亲神经性更弱，因此gE可能在侵蚀和传播神经系统中有更重要的作用[23]。TK也是主要毒力基因，与建立和激活神经潜伏状态，在中枢神经中增殖有关[24]，当缺失TK时，病毒增殖不受到影响，但毒力和侵染力大幅度降低[25]，因此在基因缺失苗研发中常使用缺失TK的PRV毒株。通过gB、gC、gE和TK全基因的遗传进化分析建立进化树，PRV FJ01株、PRV FJ03株和PRV MS2018株与2011年后分离的变异株亲缘性相近，而YK株与国外毒株在同一进化分支上，与国内毒株亲缘性较远。4株分离PRV的gB核苷酸序列与国内外PRV参考株的同源性为97.7%～100%；gC核苷酸序列与国内外PRV的同源性为89.3%～99.9%；gE与国内外PRV的核苷酸同源性为96.1%～99.8%；TK基因与国内外PRV的核苷酸同源性为97.9%～100%。分析各个毒株分别与2011年至今流行的PRV的毒力基因同源性，发现同源性较高，说明2011后的流行毒株间变异较小。

通过分离出来的4个毒株与国内市面上主要流通的疫苗毒株如Bartha-K61株和SA215株进行基因序列比对有一些变异，虽然目前流行病学数据显示我国猪场加强疫苗免疫可以大部分防控PRV，但不能完全清除，这与我国还有许多散户，养殖环境等有关，这可能也是PRV仍在流行变异的原因之一[26]。为了防控新变异PRV，以近年流行的PRV为亲本研发新型疫苗可能对猪起免疫保护作用更加有效；且随着全基因组测序的普及，关于PRV遗传变异的研究越来越多，数据库越来越大，发现PRV虽然GC含量高，结构稳定，但仍出现变异，YK毒株分离于近年感染伪狂犬病的病料，其免疫原性基因gB、gC和gE与国外毒株相近，TK在进化树上位于独立分支上，TK毒株是否出现基因重组，需要从全基因组角度来进行进一步探究。