新疆蟠桃叶附生酵母种群结构分析

刘欢, 张媱, 王翀, 孙燕飞, 雷勇辉

新疆蟠桃叶附生酵母种群结构分析

刘欢1, 张媱1, 王翀3, 孙燕飞1, 雷勇辉2,*

1. 石河子大学生命科学学院,石河子 832003 2. 石河子大学农学院,石河子 832003 3. 新疆出入境检验检疫局,乌鲁木齐 830063

通过Illumina MiSeq平台, 对石河子143团两个蟠桃园所采集的叶片样本附生酵母菌26S rDNA D1/D2区进行高通量测序, 并分析了其物种的组成、Alpha多样性以及菌种群落结构。结果显示,两个桃园中共检测到1470个OTU(Operational Taxonomic Units, 操作分类单元), 桃园1中含有个1217个OTU, 桃园2中含有609个OTU, 其中有356个为共有OTU。共鉴定出酵母菌2门22属, 属于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota), 两个桃园共有的酵母属有线黑粉酵母属(), 接合酵母属(), 红酵母属(), 隐球酵母属(),, 毕赤酵母属(), 假丝酵母属(),,, 两个桃园优势属均为线黑粉酵母属。研究结果表明石河子地区蟠桃叶表面附生酵母菌资源丰富, 值得进一步开发与利用。

蟠桃叶; 附生酵母; 高通量测序

0 前言

植物表面栖居有大量的微生物, 但直至上世纪上半叶, 叶面微生物仍为人们所忽视, 相反, 这段时间内对土壤微生物的研究众多[1–2]{Eaton, 1931 #30;Clark, 1949 #32;TIMONIN, 1941 #31;Waksman, 1922 #33}, 在土传植物病原菌生物防治的研究方法上取得了很大的进展, 为植物叶部微生物的研究提供了宝贵的研究方法和经验。近年来, 植物叶部微生物的研究逐渐受到重视[3], 对植物叶片表面的酵母菌的研究也进入研究人员的视线。酵母菌拥有丰富的酶系统和蛋白质, 可以为其他生物体提供营养物质, 可以代谢重金属或者降解某些难降解的物质, 维持生态环境的稳定[4], 叶片作为植物的营养器官, 为植物提供有机物, 进行蒸腾作用, 对植物有着至关重要的作用。从叶面分离到的许多酵母能够合成β-吲哚乙酸, 它是一种植物激素, 具有生长素活性[5], 在植物体内, 作为执行细胞通讯的化学信息在代谢、生长、形态建成等植物生理活动的各个方面起着十分重要的作用[6]。本世纪以来, 中外学者逐渐开展了对不同植物叶片酵母菌的研究。R Zvyagilskaya 等人在以色列耐盐、耐干旱植物滨藜排盐的叶片表面分离出几种好氧、中等耐盐和耐碱酵母[7]。AM Glushakova 等人研究了25种植物叶片表面附生的酵母菌群落结构的季节性动态变化, 指出一般来说植物个体发育周期越长, 植物叶片附生酵母的多样性越高[8]。。董坤等人的研究结果表明霉菌和酵母菌是普洱茶发酵制作过程中主要微生物种类, 其中, 酵母主要产生酒精和产脂, 对普洱茶的品质、风味形成起主要作用[9]。

蟠桃()是李亚科, 桃的变种, 以其形美、色艳、多汁、味美、汁多甘厚、味浓香溢等特点而驰名海内外, 新疆是蟠桃的原产地, 石河子一四三团的蟠桃属于蟠桃的极品。一四三团从1955年开始大面积种植蟠桃, 至今已经有60多年蟠桃种植历史, 该地种植的蟠桃个大、味甜、汁多, 被誉为“人间仙果”[10]。目前, 还未有人对蟠桃桃叶表面附生酵母菌的物种多样性进行研究, 因此, 我们在一四三团两个人工种植蟠桃园采集桃叶样本, 采用近年来兴起的Illumina MiSeq高通量测序技术(High-throughput sequencing), 对叶片表面酵母菌26S rDNA D1/D2区域进行测序, 相较于传统的分子生物学, 高通量测序方法具有准确性高、速度快、成本低等优点[11], 能客观并且更全面地反应微生物多样性[12], 可以全面而准确地分析蟠桃叶片表面酵母菌菌群结构, 以了解叶片表面酵母菌菌群的组成特点, 为该地区酵母菌的开发提供参考资料。

1 材料和方法

1.1 桃叶样本的采集

采样时间及地点: 2017年8月, 本研究采样地点为新疆石河子地区一四三团相距10 km的两个不同桃园, 两个桃园中树龄分布均不一致, 在两个桃园中随机选取若干长势良好的桃树, 在选定的桃树树冠分别采取大小均匀、无伤病的叶片各约20 g, 混合均匀, 装入带有编号的塑封袋中密封后放入4 ℃冰箱保存。石河子地区一四三团, 地处天山北麓, 位于北纬43°26′—45°20′, 东经84°58′—86°24′之间, 属于典型的温带大陆性高原气候, 冬季漫长严寒, 夏季较短炎热, 日照充沛, 年日照时数为2721—2818 h, 夏季平均温度在25.1 ℃—26.1 ℃之间、降水量在125.0—207.7 mm之间。

1.2 桃叶基因组DNA提取以及MiSeq测序

分别将两个桃叶样本与无菌水按1: 2比例置于锥形瓶中, 摇床6 h后将桃叶在无菌条件下过滤, 留下过滤后的液体用0.45 μm的滤膜进行抽滤, 提取抽滤后滤膜上的DNA, 送至上海派森诺生物科技有限公司对样品的26S rDNA D1/D2区进行高通量测序, 使用带Barcode的26S rDNA特异引物NL-1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL-2 (5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC-3′), 测序使用Illumina (MiSeq)平台。

1.3 生物信息学分析

下机数据经过预处理, 去除低质量reads, 根据PE数据之间的overlap关系将成对的reads拼接成一条序列, 去除tags两端的Barcode序列及引物序列, 去除嵌合体及其短序列等后得到优化序列。拼接过滤后的优化序列, 在97%相似度下利用QIIME (v1.8.0)软件将其聚类为用于物种分类的OUT (Operational Taxonomic Units), 以对获得的序列进行OTU归并划分, 每个OTU的代表序列用于分类地位鉴定, 统计各个样品每个OTU中的丰度信息, OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。

1.4 Alpha多样性分析

对新疆石河子地区蟠桃叶高通量测序结果进行α多样性的相关分析,基于OTU结果, 计算Shannon指数, Chao 1指数, 谱系多样性共3个指数来进行生物多样性分析, 样本在群落的丰富度和均匀度与指数值为正相关关系[13]。丰富度指数(Chao 1、ACE)和多样性指数(Shannon)的计算利用Mothur 1.30.1软件完成。

1.5 物种组成分析

获得的OTU与RDP数据库(Release 11.1, http:// rdpcme.msu.edu/)比对, 通过RDP Classifier鉴定OTU代表性序列的微生物分类地位。各组样品在不同水平的分类比较柱形图是根据QIIME (v1.8.0)软件计算结果用Origin 9.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 OTU水平分析

利用Illumina Miseq测序平台对2个样品进行测序, 经过数据前处理, 得到的测序长度集中在230—340 bp之间。两个样品共产生4902个OTU, 原始OTU丰度矩阵中丰度值低于全体样本测序总量0.001%(十万分之一)的OTU可能是由于测序错误造成的, 将这部分OTU去除, 不加入后期分析, 故两个样品的OTU数为1470个。2个样品的OTU分类结果(表1)显示, 桃园1(L1)与桃园2(L2)所测得的OTU在各个分类水平上均有明显差异, 桃园1 OTU在各个分类水平上的相对丰度远高于桃园2。通过Venn图(图1)可以显示桃园1特有OTU 861个, 桃园2特有OTU 253个, 两个桃园共有OTU 356个,表明桃园1与桃园2 OTU水平有明显差异, 桃园1中特有OTU数目远高于桃园2。

2.2 Alpha多样性分析

在当前的测序量下, 每个桃叶样本的Shannon曲线与Chao 1曲线(图2)都接近平台期, 这表明选取的样本测序量能够充分反映待测样本真菌菌群结构的合理性及多样性。

两个样本中真菌Alpha多样性指数存在明显差异(表2), 桃园1中真菌丰富度指数Chao 1和ACE指数远大于桃园2, 说明L1中蟠桃叶附生真菌群落更为丰富。真菌多样性指数Shannon指数分别为6.28和5.59, L1多样性指数高于L2, 说明L1中真菌多样性高, 真菌种类较多, 且均匀度较好, 而L2中真菌种类较少, 群落多样性较低, 均匀度稍差, 优势菌更加明显。

表1 样品OTU分类结果统计

图1 样品共有OTU维恩图

Figure 1 The venn diagram of the shared OTU graph of samples

图2 Shannon指数(A)和Chao 1指数(B)曲线分析图

Figure 2 Shannon index(A) and Chao 1 index(B) curves in the samples of leaves of flat peach

表2 蟠桃叶附生真菌的生物多样性指数

2.3 桃叶附生酵母菌种群结构组成分析

获得的酵母OTU与RDP数据库比对, 通过RDP Classifier鉴定, 可以获得样本中酵母菌在各分类水平的具体组成(表3)。类群数统计结果表明, 两个桃园桃叶附生酵母在门纲目科属水平上数目相差不大, 但在种水平上, 桃叶1与桃叶2附生酵母菌分别有72和51种, 桃叶1酵母菌类群数相对丰度高于桃叶2。

两个桃叶样本表面附生的酵母菌菌群组成既有共性, 又存在一定差异(图3)。图3A为两个样本在门分类水平上的组成结果, 桃叶1中的担子菌门(Basidiomycota)占酵母菌菌群57.6%, 子囊菌门(Ascomycota)占酵母菌菌群42.4%, 而桃叶2中的担子菌门占酵母菌菌群52.5%, 子囊菌门占酵母菌菌群47.5%。在属分类水平上(图3B), 桃叶1和桃叶2分别包含有15个和16个酵母属, 但属的种类有差异, 两个桃园共包含22个属。其中两个桃园共有的属有9个, 为线黑粉酵母属(), 接合酵母属(s), 红酵母属(), 隐球酵母属,, 毕赤酵母属(), 假丝酵母属(),,, 他们在桃园1和桃园2中所占比例分别为76.65%和90.06%, 8.38%和0.28%, 7.98%和0.83%, 2.80%和1.38%, 1.20% 和0.55%, 1.00%和0.83%, 0.20%和1.10%, 0.20%和0.83%, 0.20%和0.55%。两个桃园样本均以线黑粉酵母属() 为优势属, 图3B中显示桃园1相比桃园2酵母属的分布更加均匀, 桃园2线黑粉酵母属优势更加明显。

桃园1中有6个特有属: 棍孢属() 0.40%, 梗孢酵母属()0.20%, 三角酵母属()0.20%,0.20%, 兔粪酵母属()0.20%, 海洋嗜杀酵母() 0.20%; L2中有7个特有属:1.10%,0.55%, 掷孢酵母属() 0.55%, 裂殖酵母属()0.55%, 双足囊菌属()0.28%,0.28%, 梅奇酵母属()0.28%(图3B)。由此可见, 两个桃园中特有的种属种群数量都不是很高。

3 讨论

本实验基于Illumina MeSeq平台, 采用26S rDNA D1/D2区域序列高通量测序, 首次对石河子一四三团两个蟠桃园内桃叶表面酵母菌群进行了分析, 探索了蟠桃桃叶表面酵母菌的种群结构及多样性。引物NL1和NL4是酵母菌测序的通用引物, 但对于高通量测序而言片段过大, 故本研究采用引物NL1和NL2, 通过该引物测序, 两个桃叶样本获得了酵母菌共2门22属, 在门分类水平上, 两个样本都集中在担子菌门和子囊菌门, 在属分类水平上, 桃叶1和桃叶2分别包含有15个和16个酵母属, 结果表明该引物对酵母菌有一定的特异性, 但除了酵母菌外, 还检测到其他非酵母真菌, 如小球腔菌属()、分子孢子菌属()和曲霉属()等, 因此本实验数据分析时候要剔除非酵母菌物种。林建春等人使用高通量测序方法研究清香型白酒发酵中酵母种群结构时, 先提取酒醅宏基因组, 之后对细菌、酵母和霉菌进行荧光定量, 高通量测序时所用的引物为真菌的ITS2区域的ITS3(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[14], 关于酵母菌高通量测序特异性引物的选择需要进一步进行研究。此外, 在种的分类水平上, 两个桃叶1与桃叶2分别获得了72和51个酵母种, 结合所分离的可培养酵母菌种类(未发表)来看, 石河子地区蟠桃桃叶附生酵母菌种群数量十分可观, 还有很多酵母菌资源值得我们进一步分离、开发。

表3 各分类水平的酵母菌类群数统计

图3 门分类水平(A)和属分类水平(B)丰度分布柱状图

Figure 3 Histogram of fractional abundance in phylum and genus classification levels

此次两个采样地点距离较近, 所处生态环境相似, 而测序结果两个桃园样本酵母菌种群结构虽有一致性, 但也存在差异, 均发现了特有的酵母属, 可能是由于酵母菌所处的微环境不同, 推测其具体原因主要为桃园管理方式的不同, 桃园1管理良好, 桃树长势很好; 桃园2中杂草丛生, 田管处理不是很好, 桃园1与桃园2相比环境更加稳定, 外界干扰较小, 故桃园1酵母菌种群相对呈现出更强的均匀性, 此外, 施肥、浇水、土壤等天然条件也可能是导致酵母菌种类不同的原因。从高通量测序结果来看, 两个桃园样本中所占比例较大的酵母属有线黑粉酵母属, 接合酵母属, 红酵母属, 隐球酵母属。线黑粉酵母属主要位于植物体内及表面, 高原湖泊也有分布, 有研究表明黑粉酵母菌可以产生α-淀粉酶等多种胞外酶[15], 目前对于微生物胞外酶的研究已经取得了明显的成就, 微生物由于其多样性、可再生性和对遗传操纵的敏感性, 显示出巨大的产酶潜力[16], 进一步研究有助于疾病控制, 社会生态环境平衡[17], 具有广泛应用前景。研究报道发酵性接合酵母有较强的富硒能力, 生产中可将富硒酵母制成饲料补充动物体内硒的含量, 降低死亡率, 改善繁殖性能等[18]。红酵母属酵母菌是世界各大洋和中国海的优势菌[19], 在空气中经常出现, 海藻、树叶、木片等基物中也有分布。红酵母菌发酵可以生产天然的β-胡萝卜素[20], 可以有效保护细胞内生物大分子不受自由基的损伤、维持正常生命代谢、防治衰老和癌症, 利用红酵母提取色素简单方便, 成本低廉[21], 具有很大的实用价值。隐球酵母菌可以从水果, 果蝇的肠道, 树皮和与树结合的苔鲜和地衣中分离到。相光明等人对隐球酵母菌高效产脂发酵条件进行了研究[22], 微生物产脂具有油脂含量高、生产成本低、可连续生产、周期短、不受季节和气候影响的优点, 产品可用于制取生物柴油、类可可脂及高档食用调和油等[23], 高值化潜力大, 具有广阔的工业化应用前景, 可以由此开辟新的油脂资源。因此, 本研究对桃园酵母菌资源进一步开发利用奠定了一定的理论基础。

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Community structure analysis of yeast attached to flat peach leaves in Xinjiang

LIU Huan1, ZHANG Yao1, WANG Chong3, SUN Yanfei1, LEI Yonghui2,*

1. College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, China 2. Agricultural college of Shihezi University, Shihezi 832003, China 3. Xinjiang Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau, Urumqi 830063, China

To study the structural diversity of the epiphytic yeasts isolated from leaves of flat peach in Shihezi, we used 26S rDNA Illumina Miseq high-throughput sequencing method to analyze the composition of species, the Alpha diversity and the composition of yeast community structure of epiphytic yeasts which were isolated from the fresh leaves of tow flat peach orchards in Shihezi.The result showed that a total of 1470 OTU(Operational Taxonomic Units) were detected through 26S rDNA high-throughput sequencing. There were 1217 OTU in orchard 1 and 609 OTU in orchard 2, among which 356 OTU were shared. All yeasts were classified into 2 plylums and 22 genus in the two samples by identification. Basidiomycota and Ascomycetes were the dominant plylums of both tow flat peach orchards. The shared genus of tow samples were,,,,,,,and. The dominant genu of two samples wasIn conclusion, we know that there are abundant yeast resources on the surface of flat peach leaves in Shihezi area, and it is worthy of further study for exploitation and utilization.

flat peach leaf; epiphytic yeast; high-throughput sequencing

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.04.005

Q938.1

A

1008-8873(2019)04-029-06

2018-06-07;

2018-08-28基金项目:国家自然科学基金项目(31860003)

刘欢(1998—), 女, 山西运城人, 主要从事微生物资源研究, E-mail: 1042441810@qq.com

雷勇辉(1978—), 男, 硕士, 主要从事生物学研究, E-mail: 497976@qq.com

刘欢, 张媱, 王翀, 等. 新疆蟠桃叶附生酵母种群结构分析[J]. 生态科学, 2019, 38(4): 29-34.

LIU Huan, ZHANG Yao, WANG Chong, et al. Community structure analysis of yeast attached to flat peach leaves in Xinjiang[J]. Ecological Science, 2019, 38(4): 29-34.