木霉菌Tr61桑叶发酵产物对辣椒种子萌发及幼苗生长的促进作用

张爱民， 邢 丹， 梁传静， 牟玉梅， 袁 圆

(贵州省农业科学院 辣椒研究所， 贵州 贵阳 550006)

木霉菌(Trichodermaspp.)属于半知菌亚门，丝孢纲、丝孢目、粘孢菌类，广泛存在于土壤中，除个别为弱病原菌外，大多数对植物病原真菌有拮抗作用，具有广谱性、广泛适应性及多机制性等特点[1]。此外，木霉菌还可通过分泌植物生长激素等物质抑制或降解根际有害物质或增加养分利用率，促进植物生长[2-6]。木霉菌作为主要生防菌已被广泛开发利用，固体发酵是扩大生物量，降低生产成本的主要途径[1]，目前用于木霉菌固体发酵的原料主要是农作物废弃物及畜禽粪便[7-12]。蚕桑产业是贵州省的重要产业之一，2016年统计表明，贵州省桑园面积约8 000 hm2[13]。2017年蚕桑写入中央一号文件，加之全省蚕桑产业的发展优势[14]，该产业有迅猛发展之势，但该产业存在的问题是资源利用率偏低，以桑树为例，每年桑园产生的过剩桑叶约为13 500 kg/hm2[15]，包括夏伐、春伐及不良桑叶的产生等。桑叶中含有大量营养物质，如多糖、蛋白质和有机酸等，在中药及食品加工中用途广泛[16]，但利用率低，仍然有大量桑叶被浪费，有研究显示，用康宁木霉发酵桑叶可显著提高饲用桑叶的蛋白质含量、降低粗纤维含量[17]。由此推测，可利用木霉菌产蛋白酶、纤维素酶的特点及桑叶的富含蛋白质和纤维素的特性生产加工有机肥，使过剩桑叶得以合理利用，并寻找合适的木霉菌固体发酵原料，开拓其应用途径，提高利用率。为此，研究以筛选的对辣椒疫霉菌具有拮抗作用的木霉菌Tr61为供试菌株，以桑叶为原料制备木霉菌固体发酵物，探究发酵物作为有机肥对辣椒种子萌发及幼苗生长的影响，为该发酵物的应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株 辣椒疫霉菌拮抗木霉菌株Tr61，由贵州省农业科学院辣椒研究所分离纯化保存。

1.1.2 桑叶 桑树下部老叶，采自贵州省农业科学院辣椒研究所贵阳试验基地。

1.1.3 种子 辣研2号(朝天椒)，贵州省农业科学院辣椒研究所选育品种；茄门甜椒，市购。

1.1.4 培养基 马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)，每升含马铃薯浸出粉3 g，葡萄糖13.3 g。

1.1.5 仪器设备 超净工作台、恒温培养箱、小型液体发酵罐(5 L)、粉碎机、超声波清洗仪、高压灭菌锅等。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

1) 木霉菌Tr61液体发酵。采用小型发酵罐发酵，发酵液为PD。培养条件：28℃，初始pH 5.9，120 r/min，DO160，发酵7 d。其中一部分混合发酵液将菌丝打碎，制成固体发酵菌种，用作固体发酵；另一部分过滤去菌丝，滤液保存备用。

2) 桑叶自然发酵。采集桑树下部老叶，自然堆置发酵，待桑叶完全腐烂变黑为止，收集发酵过程的渗出液，备用。

3) 木霉菌Tr61桑叶固体发酵物浸提液的制备。称取200 g桑叶烘干粉碎、高压灭菌，加入上述固体发酵菌种1 000 mL，拌匀，放入浅盘，覆盖保鲜膜，28℃发酵15 d。称取固体发酵物20 g，加入无菌水200 mL，50℃超声提取1 h，8层纱布过滤后，再用滤纸过滤，取滤液备用。

1.2.2 浸提液对种子萌发的影响 试验设8个处理： 1) 对照(CK1)，无菌水。2) CH，高压灭菌马铃薯葡萄糖(PD)溶液(参比对照)，即PD溶液稀释10倍，高压灭菌。3) TF，木霉菌PD发酵液过滤液用0.2 μm无菌滤膜抽滤后，用无菌水稀释10倍。4) TH，木霉菌PD发酵液过滤液稀释10倍，高压灭菌。5) MF，桑叶发酵液抽滤灭菌后稀释10倍。6) MH，桑叶发酵液稀释10倍，高压灭菌。7) MTF，桑叶发酵物浸提液滤液抽滤灭菌，稀释10倍。8)MTH，木霉菌桑叶发酵物浸提液滤液稀释10倍，高压灭菌。

将种子用55℃左右温水浸种15 min后晾干。在9 cm培养皿中铺2层灭菌滤纸，每个处理加入相应的溶液10 mL，种子50粒，浸泡24 h后弃去多余的溶液，3次重复。每天观测记录发芽种子数，视滤纸干湿程度加入相应的溶液保持滤纸湿润。

观测指标：从开始发芽起，每天观察并记录种子发芽数，第14天试验结束；每皿随机抽取10株测量胚根长、胚轴长，计算发芽率(GR)、发芽势(GP)、发芽指数(PI)和胚根长/胚轴长。

GR=正常发芽种子数/供试种子数×100%

GP=第7天供试种子发芽数/供试种子总数×100%

PI=1.00nd2+0.75nd4+0.5nd6+0.25nd8

式中，nd2、nd4、nd6及nd8分别表示第2天、第4天、第6天和第8天时的种子发芽率[18]。

1.2.3 木霉菌Tr61固体发酵物对辣椒幼苗生长的影响 试验设4个处理：对照(CK2)，纯育苗基质；T1，育苗基质+木霉菌桑叶发酵物，W∶W =10∶1；T2，育苗基质(干重880 g)+木霉菌分生孢子悬浮液1 000 mL(孢子悬浮液浓度为1×106个/mL)；T3，育苗基质+桑叶自然发酵物，W∶W =10∶1。采用漂浮育苗法育苗，各处理每个品种辣椒播种160粒种子，28℃培养，播种后第20天记录成苗数，第45天每个处理随机选取30株测量幼苗茎粗、株高、根长、叶长、叶宽及真叶数等指标。

1.3 数据处理

采用EXCEL进行数据整理并作图，用SPSS Statistics 17.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 木霉菌Tr61桑叶发酵物浸提液对辣椒种子萌发的影响

从图1看出，不同溶液处理辣研2号和茄门甜椒种子的萌发状况。

2.1.1 发芽率 不同溶液处理辣研2号种子的发芽率依次为MTH(99.33%)>MF(98.67%)=TF(98.67%)>MH(98.00%)=CH(98.00%)>CK1(97.33%)>TH(96.67%)>MTF(96.00%)；茄门甜椒种子的发芽率依次为MTF(87.33%)=TH(87.33%)>CH(84.67%)>MF(81.33%)>MH(80.67%)>TF(78.67%)>MTH(78.00%)>CK1(77.33%)。相同溶液处理辣研2号种子的发芽率均较茄门甜椒高。方差分析表明，同一品种辣椒种子的发芽率各处理间无显著差异。

2.1.2 发芽势 辣研2号种子的发芽势以MTH最高，为96.00%；其余处理发芽势为MTF(92.00%)>CK1(88.00%)>MH(87.33%)>CH(84.00%)>TH(76.00%)>MF(68.67%)>TF(64.67%)；MTF、MTH与CK1、MH无显著差异，但二者与其他处理差异显著；TF的发芽势除与MF的差异不显著外，与其余处理间均存在显著差异。茄门甜椒种子的发芽势为TH(69.33%)>MH(66.00%)>MF(64.67%)>MTF(64.00%)>MTH(61.33%)>CK1(57.33%)>CH(56.00%)>TF(53.33%)。相同溶液处理辣研2号种子的发芽势较茄门甜椒高。

2.1.3 发芽指数 不同处理辣研2号种子发芽指数的变化趋势与发芽势相似，MTF和MTH的发芽指数分别为50.43和49.75，除与MH(45.87)、CK1(44.79)间差异不显著，与其余处理间差异显著；TF与TH差异不显著，二者与其余处理间差异显著。各处理茄门甜椒的发芽指数变化趋势与辣研2号相似，在TF处理下最低(19.56)，但各处理间无显著差异。相同溶液处理辣研2号种子的发芽指数均较茄门甜椒高。

注：图中不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different treatments in the same variety (P<0.05).The same below.

图1木霉菌Tr61桑叶发酵物浸提液处理辣椒种子的萌发状况

Fig.1 Germination of pepper seeds treated with extract liquid ofTrichodermaTr61 + mulberry leaf fermentation broth

2.2 木霉菌Tr61桑叶发酵物及其浸提液对辣椒幼苗生长的影响

2.2.1 胚轴长和胚根长 试验后期由于茄门甜椒种子及幼苗霉烂较多，未进行胚根长及胚轴长测定。从图2可知，各处理辣研2号胚根长、胚轴长和胚根长/胚轴长的变化趋势。各处理胚轴长和胚根长的变化趋势相似，CH的胚轴长和胚根长最长，分别为3.51 cm和3.53 cm，与MTF(3.39 cm、3.05 cm)差异不显著，与MTH(2.74 cm、2.72 cm)差异显著；MTF和MTH的胚轴长分别为3.39 cm和2.74 cm，胚根长分别为3.05 cm和2.72 cm，显著大于CK1(2.36 cm和1.66 cm)，MTF和MTH的胚轴长分别比CK1提高44.00%和16.10%，胚根长分别高84.00%和64.06%，胚根长/胚轴长分别高29.00%和46.13%。MH和MF间差异不显著，二者的胚轴长、胚根长和胚根长/胚轴长比值显著小于其余处理。

2.2.2 种子成苗率 由表1可知，基质中不同的添加物对辣椒种子成苗率均有一定影响，辣研2号和茄门甜椒2个品种的成苗率均以CK2最高，分别为68.75%和69.38%，其中T1比CK2分别降低24.54%和23.42%。辣研2号T1和T3的成苗率相当，略高于T2；茄门甜椒T2和T3的成苗率相当，略高于T1。

图2 木霉菌Tr61桑叶发酵物浸提液处理辣研2号幼苗种胚的生长状况

表1木霉菌Tr61发酵物处理辣椒种子的成苗率

Table 1 Seedling rate of pepper seeds treated withTrichodermaTr61 fermentation product

处理Treatment辣研2号Layan 2苗数/株成苗率/%茄门甜椒Sweet pepper苗数/株成苗率/%CK211068.7511169.38 T1 8351.88 8553.13 T2 7546.88 10364.38 T3 8855.0010867.50

2.2.3 幼苗农艺性状 从表2可知，添加不同物质的育苗基质对辣椒幼苗农艺性状的影响存在一定差异。

1) 茎粗。辣研2号幼苗茎粗CK2最小，与其余各处理间差异显著，T1比CK2提高30.89%；T3茎粗最大，平均直径为1.78 cm，与T1和T2差异显著，说明育苗基质+桑叶自然发酵物有利于辣研2号幼苗生长。茄门甜椒的变化与辣研2号相似，CK2幼苗茎粗最小，其余各处理的茎粗平均值均为1.54 cm，与CK2差异显著，其中T1比CK2提高11.59%。说明，育苗基质+木霉菌桑叶发酵物，育苗基质(干重880 g)+木霉菌分生孢子悬浮液1 000 mL以及育苗基质+桑叶自然发酵物均可促进茄门甜椒幼苗生长。

2) 株高。辣研2号和茄门甜椒均以T1幼苗的株高最高，分别为11.19 cm和8.71 cm，分别比CK2提高58.72%和61.90%，较同一品种其余处理差异显著；T3其次，为10.54 cm和7.92 cm；CK2最低，为7.05 cm和5.38 cm。说明，育苗基质+木霉菌桑叶自然发酵物有利于2种辣椒幼苗株高增高。

表2 木霉菌Tr61发酵物处理辣椒幼苗的生长情况

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05 level.

3) 根长。辣研2号的根长依次为T3(8.45 cm)>T1(6.56 cm)>CK2(4.93 cm)>T2(3.65 cm)，T3与其余处理间差异显著；T1比CK2提高33.06%，显著高于CK和T2。茄门甜椒的根长依次为CK2>T2>T1>T3，CK2和其余处理间差异显著，其中，T1比CK2下降39.62%，但其余3个处理间差异不显著。

4) 叶长和叶宽。2个品种的叶长和叶宽变化趋势相似。辣研2号的叶长和叶宽为T3>T2>T1>CK2，T3与其余处理间存在显著差异。茄门甜椒均表现为T2>T3>CK2>T1，T2与其余处理间存在显著差异。说明，育苗基质+桑叶自然发酵物有利于辣研2号叶的生长，而育苗基质(干重880 g)+木霉菌分生孢子悬浮液1 000 mL有利于茄门甜椒叶的生长。

5) 真叶数。辣研2号的真叶数依次为T3(9.43片)>T2(7.70片)>CK2(7.57片)>T1(7片)，T3和CK2分别与其余处理差异显著。茄门甜椒的真叶数依次为CK2(5.73片)>T1(5.30片)=T2(5.30片)>T3(5.00片)，CK2与其余处理间差异显著。

3 结论与讨论

3.1 木霉菌Tr61桑叶发酵物浸提液对种子萌发的促进作用

发芽率反映种子的生活力，发芽势主要体现种子的发芽速率和整齐度，发芽指数则是反映种子的萌发速率和整齐度的另一个重要指标。研究结果表明，各溶液处理2个辣椒品种种子的发芽率较清水对照(CK1)的变化不显著，说明，木霉菌发酵液、桑叶自然发酵浸提液和木霉菌桑叶发酵物浸提液对辣椒种子的生活力没有影响；各溶液处理辣研2号种子的发芽势和发芽指数出现显著差异，2个指标均以TF(抽滤灭菌木霉菌发酵液)最低，并且显著低于CH(高压灭菌PD溶液)，说明溶液中的葡萄糖并不是影响种子萌发的重要因素，而可能是木霉菌在发酵过程中产生了对种子萌发有抑制作用的物质。MTF和MTH(高压灭菌木霉菌桑叶发酵物浸提液)的种子发芽势与发芽指数均高于其余处理，可能是因为木霉菌桑叶发酵的产物中存在能够促进种子萌发的物质。整体看，茄门甜椒的种子发芽状况较辣研2号差，其发芽率、发芽势和发芽指数均明显低于辣研2号，且3个指标在各处理间均无显著变化，可能与辣椒种子质量有关，种子生活力较差的情况下，生长促进或抑制物对该种子的萌发无明显作用。

不同溶液对辣研2号种子萌发后胚根和胚轴生长的影响存在显著差异。其中，MH(高压灭菌桑叶发酵液)和MF胚根和胚轴长均低于CK1，三者间差异不显著，但三者均低于其余各处理；MH和MF低于CK1可能是因为浸提液中的某些物质抑制了培根和胚轴的生长。MTF和MTH的胚根长和胚轴长显著高于MH和MF，可能是因为木霉菌发酵桑叶过程中消耗了对幼苗生长有抑制作用的物质。CH与TH(高压灭菌木霉菌PD发酵液)、TF的胚轴长和胚根长均较高，可能与溶液中含有一定量的葡萄糖有关。

总之，当种子具有较好的生活力时，木霉菌桑叶发酵物的浸提液有利于提高种子萌发的整齐度，并且对胚根和胚轴生长具有一定的促进作用，其作用均优于木霉菌液体发酵液或桑叶自然发酵物的浸提液。说明，桑叶可以作为木霉菌发酵的原材料，可用于生产木霉菌生物有机肥，也可为桑叶的有效利用提供一条新途径。

3.2 木霉菌Tr61桑叶发酵物对辣椒幼苗生长的促进作用

育苗基质中添加其他物质均使辣椒成苗率有所降低，原因可能是发酵产物中的物质对种子萌发有一定抑制作用。其中，基质+木霉菌桑叶发酵物与基质+木霉菌分生孢子悬浮液处理的种子成苗率较其余2个处理的成苗率低，结合发酵物浸提液对辣椒种子萌发试验中TH和TF对辣椒种子发芽势和发芽指数的影响看，木霉菌对种子萌发产生抑制作用的可能性较大。

育苗基质中添加其他物质各处理的其他测定指标较纯育苗基质(CK2)均有一定的提升，尤其是茎粗和株高，3个处理的测定值均高于CK2，说明在幼苗生长后期，不同的添加物可能发挥了一定效用，促进了幼苗地上部分的生长，尤其是真叶数的增加。说明，在相同时间内，桑叶自然发酵物的添加可能对缩短苗龄，促进幼苗快速生长有一定作用。

研究结果表明，木霉菌或桑叶发酵物对辣椒种子萌发可能有一定的抑制作用，而对幼苗生长具有一定的促进作用，产生该现象的原因可能是发酵物中存在抑制种子萌发和促进幼苗生长的物质，也可能是有机物添加过多造成了烧苗现象。因此，有机物的添加比例和添加时期还有待于进一步研究。