四种苦荞茎叶提取物对甘薯多酚氧化酶的抑制效果研究

刘辉　周罗娜　贺圣凌　王梅?罗林丽

[摘要]多酚氧化酶（PPO）是导致甘薯褐变的关键酶。以4个苦荞品种（黔苦2015、黔苦2号、黔农7014、西农9940）为材料，进行室内发芽培养获得幼苗，收集茎叶，并磷酸盐缓冲液为提取液获得4种苦荞茎叶提取物，研究其对甘薯块茎PPO的抑制效果。结果表明，黔农7014苦荞品种的茎叶磷酸盐提取物的抑制效果最佳，抑制类型为非竞争性可逆过程，抑制常数（KI =KIS）为33.53 μL。研究结果可为探寻甘薯PPO的天然抑制剂奠定关键基础。

[关键词]苦荞;茎叶;多酚氧化酶;黑美人马铃薯;抑制剂

[中图分类号]TS215[文献标识码]A

甘薯富含淀粉、糖类、蛋白质、维生素、纤维素以及各种氨基酸，同时含有丰富的黏液蛋白，是非常好的营养和保健食品，被誉为“抗癌之王”。然而，甘薯块茎中的多酚氧化酶，可与多酚类物质酶反应形成褐变物质，严重影响甘薯产品色泽、品质，影响甘薯的市场竞争力。研究发现植物来源的天然提取物对PPO酶促褐变具有显著的抑制效果，加之天然提取物具有无毒无害的特性，使之成为当前褐变抑制剂开发的热点。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

甘薯和苦荞由贵州省农业科学院生物技术研究所提供。试剂均为国产分析纯。所需仪器包括高速冷冻离心机、低温真空冷凍干燥器、超微粉碎机、分光光度计，旋转蒸发仪等。

1.2 方法

1.2.1 甘薯PPO的提取与纯化。甘薯PPO的提取与纯化参考彭益强等的方法。

1.2.2 苦荞茎叶的提取方式。参考刘辉等的方法获得苦荞茎叶提取物。

1.2.3 PPO动力学研究方法。参照林敏等的方法进行PPO动力学研究。

2 结果与分析

2.1 不同苦荞品种对甘薯PPO酶活力的影响

4种苦荞茎叶提取物均可显著抑制甘薯PPO酶活力，酶活力随提取物浓度的增大而显著降低（见图1）。提取物用量在120 μL以内，酶活力急剧降低，均超过50%的抑制能力。提取物用量的加大，甘薯PPO酶活力的降低趋势渐缓，表明苦荞茎叶提取物对甘薯PPO的抑制类型为可逆性抑制过程。黔苦2015、黔苦2号、黔农7014、西农9940导致酶活力下降一半所需的抑制剂量（IC50）分别为53.19μL、56.22μL、27.48μL、61.04μL，可见，黔农7014磷酸盐提取物的抑制作用最强。

2.2 黔农7014苦荞茎叶提取物对甘薯PPO抑制类型判断

在甘薯PPO测活体系中，固定底物浓度为0.5mmol/L，分别加入不同体积的苦荞茎叶磷酸盐提取物（30、60、120、240、480μL），加入不同的酶量（10、20、30、40、50μg/L），测定酶催化邻苯二酚氧化的活力。从图2可知，增加提取物用量，直线的斜率降低，表明黔农7014苦荞茎叶提取物对甘薯PPO的抑制作用，属于可逆过程。因此，苦荞茎叶提取物通过抑制酶活力而导致催化效率的降低，而不是通过降低有效的酶量抑制酶活力。

以Lineweaver-Burk 双倒数作图，得到一组横轴截距不变的直线（图3），黔苦7014茎叶提取物作为PPO 抑制剂，不影响米氏常数，只使最大反应速度减小，其抑制类型为非竞争性，抑制剂不改变酶对底物的亲和力。以不同浓度抑制剂下测定的直线在纵轴的截距（1/Vm） 对抑制剂浓度作图为一条直线（图3内插图），从直线的斜率可以求得抑制常数。苦荞茎叶磷酸盐提取物对甘薯PPO 的抑制常数（KI =KIS）为33.53μL。

3 结论

黔农7014苦荞茎叶磷酸盐提取物对甘薯PPO抑制效果最好，抑制机理非竞争性为可逆反应，抑制常数为33.53 μL。

[参考文献]

[1] 彭益强，刘鹏，邓峰，等.源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成与抑制机理[J].化工进展，2012（02）：406-411.

[2] 刘辉，卢扬，刘嘉，等.苦荞茎叶提取物对“红宝石”马铃薯多酚氧化酶抑制效果研究[J].保鲜与加工，2017（5）：1-6.

[3] 林敏，邱凌，钟雪，等.柿叶提取物对马铃薯多酚氧化酶的抑制作用[J].广西农业生物科学，2008，27（4）：412-416.