基于聚邻苯三酚修饰的甲霜灵分子印迹传感器制备与应用

王春琼，彭丽娟，李籽萱，张 燕，李 苓，陈 丹，曾彦波，李 郸，刘宇晨，曹秋娥*

1. 云南省烟草质量监督检测站, 昆明市高新开发区科医路41 号 650106

2. 云南大学化学科学与工程学院，昆明市五华区翠湖北路2 号 650091

3. 红云红河烟草(集团)有限责任公司会泽卷烟厂，云南省曲靖市会泽县金钟镇东郊 654200

烟草中农药残留的控制是保证烟草制品吸用安全的重要手段，近年来一直是烟草行业关注的焦点之一。烟草农残的有效检测技术研究不仅对于保障烟叶质量和烟草企业的利益有重要意义，而且对于保障消费者健康和生态环境安全也非常重要。甲霜灵[1]是一种广谱、高效、低毒的内吸杀菌剂，在烟草上施用非常广泛。尽管甲霜灵是低毒类农药，但由于其使用量不断提高、使用范围不断扩大，其环境生态、农药残留等问题引起了广泛的关注，世界各国对植物中甲霜灵残留量[2]都有明确的规定。因此研发出一种对甲霜灵进行快速、准确和高灵敏度定量分析方法显得尤为重要。目前，甲霜灵的检测方法主要有液相色谱法（LC）[3-5]、液质联用法（LC-MS）[6]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[7-12]和气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[12-13]，但这些方法存在成本高、耗时长、样品前处理操作繁琐等不足[14]。分子印迹传感器是以基于分子印迹技术制备的印迹敏感膜为识别元件，能够专一识别目标分子，具有制备简单、成本低廉、抗恶劣环境等优点，已被用于环境监测、药物分析和农残检测等领域[15-16]。目前，采用分子印迹传感器测定烟草农残甲霜灵的研究鲜见报道。因此，利用邻苯三酚中苯环上羟基对电极信号的放大作用，先在玻碳电极表面修饰一层邻苯三酚，再以甲霜灵为模板，苯酚为功能单体，在邻苯三酚修饰玻碳电极表面通过电聚合制备甲霜灵分子印迹膜，以构建一种应用简单、测定快速、结果准确、选择性和灵敏度高的传感器，为检测烟草农药残留甲霜灵提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

4 个初烤烟叶样品（2018 年产自云南曲靖、C3F 等级）由云南省烟草质量监督检测站提供；空白烟叶基质由云南省烟草农业科学研究院提供。

苯霜灵、烯酰吗啉、甲霜灵、氟吗啉、乐果和百菌清（标准品，99.99%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司）；苯酚、邻氨基酚、邻苯二胺、邻苯三酚和间苯二胺（AR，天津光复化工研究院）；Al2O3抛光粉（0.5 m，50 nm，纯度大于99%，浙江理协仪器设备有限公司）；去离子水（18.25 MΩ·cm）。

CHI660 型电化学工作站[采用三电极系统：工作 电 极为 玻 碳 电 极（glassy carbon electrode，GCE）及各种修饰玻碳电极，辅助电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极；上海辰华仪器有限公司]；6470 型液相色谱-串联质谱联用仪（LC-MS/MS，美国Agilent 公司）；AE-200 型电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Millipore 超纯水仪（德国Merck Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 玻碳电极预处理

1.2.2 聚邻苯三酚修饰电极的制备

称取1.51 mg 邻苯三酚于10 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液中，混匀后得到浓度为1.2 mmol/L 的邻苯三酚溶液；将预处理好的玻碳电极置于上述溶液中，浸泡10 min，用循环伏安（cyclicvoltammetry，CV）在-0.4～1.0 V 电位范围内以20 mV/s 速率聚合10 次，使邻苯三酚聚合膜沉积在玻碳电极表面；将电极用去离子水冲洗表面后，置于0.1 mol/L NaOH中，以100 mV/s 速率在-0.4～1.0 V 电位范围内扫3次CV 以去除电极表面未聚合的邻苯三酚，得到邻苯三酚修饰玻碳电极。

1.2.3 甲霜灵印迹传感器的制备

甲霜灵印迹传感器的制备过程如图1 所示。将0.16 mmol 苯酚和0.01 mmol 甲霜灵溶于10 mL硼砂-硼酸缓冲液（pH=9.0）中，通N2（＞99.999%）20 min 除氧，制得预聚合液；将修饰电极浸于预聚合液中以50 mV/s 速率在0.3～0.8 V 电位范围内扫40 次CV，使邻苯三酚修饰玻碳电极表面沉积甲霜灵分子印迹膜；聚合完成后，将印迹电极浸于甲醇/乙酸（体积比3∶1）的洗脱液中，用磁力搅拌洗脱20 min 以去除模板分子甲霜灵。非印迹传感器除不加模板分子外，其余步骤均同于印迹传感器。

图1 甲霜灵印迹传感器的制备过程示意图Fig.1 Preparation process of metalaxyl molecular imprinted sensor

1.2.4 电化学检测

将三电极系统放入待测溶液[以5.0 mmol/L K3Fe（CN）6为探针，0.1 mol/L KCl 为支持电解质]；待背景电流稳定，参照文献[17]的电化学条件利用CV 和差示脉冲法（differential pulse voltammetry，DPV）表征修饰电极的电化学性能。其中，CV 测定条件：扫描范围-0.2～0.6 V，扫描速率100 mV/s；DPV 测定条件：扫描范围和速率同CV，振幅0.05 V，电位增量0.004 V，脉冲宽度0.05 s，采样宽度0.016 s。

裸玻碳电极直接测定；各修饰电极须先在待测液中吸附2 min 后再测定。测定完毕，用洗脱液洗脱20 min，保存于4 ℃冰箱待用。

1.2.5 烟草样品前处理

①电分析方法前处理。称取1.0 g 烟末试样于25 mL 聚乙烯离心管中，加入10 mL 乙腈作为萃取液，超声提取10 min；过滤后加入3 g NaCl，静置；分层后取上层乙腈溶液1.5 mL 加入150 mg 无水硫酸镁和25 mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂净化，过滤后待检测。

②LC-MS/MS 法前处理。称取2.0 g 烟末试样于50 mL 聚乙烯离心管中，加入10 mL 水，振荡至烟末被充分浸润；静置10 min 后加入10 mL 乙腈和100 μL 内标工作液（20μg/mL 甲霜灵甲苯溶液），2 000 r/min 下涡旋振荡2 min；置于冰箱冷冻室（-18 ℃）10 min，向聚乙烯管中加入试剂净化包，2 000 r/min 下涡旋振荡2 min；4 000 r/min 下离心5 min，取上清液1.5 mL 于2 mL 试剂净化管，2 000 r/min 下涡旋2 min；4 000 r/min 下离心5 min，收集上清液待测。

1.2.6 农药残留量的计算

以干基计的甲霜灵农药残留量R，以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）计算：

式中：R—以干基计的农药残留量（mg/kg）；C—由标准工作曲线计算得到的结果（μmol/L）；V—萃取液体积（mL）；M—甲霜灵摩尔质量（g/mol）；m—样品质量（g）。

2 结果与讨论

2.1 甲霜灵分子印迹膜的表征

图2 为邻苯三酚修饰电极在含甲霜灵的苯酚预聚合液中的电聚合图。可以看出：甲霜灵的电聚合过程完全不可逆，第1 次CV 扫描在0.7 V 左右出现明显氧化峰，说明苯酚聚合物在电极表面沉积。随着CV 扫描次数的增加，苯酚在电极表面逐渐形成绝缘聚合膜，抑制了电极表面的伏安响应，使氧化峰逐渐消失，电流响应逐渐减弱，聚合反应不再发生。

2.2 传感器的分子印迹效应

图2 苯酚电聚合苯酚循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammograms of electropolymerization phenol

由于印迹膜中印迹孔穴可作为电子传质通道，通道中发生的分子识别行为可改变电活性物质的量，使铁氰化钾的氧化电流信号发生变化，因此可通过铁氰化钾氧化还原的电流信号研究膜的形态特征并间接分析被测物浓度[18]。甲霜灵在-0.2～0.6 V 电位范围内不出峰，因此借助铁氰化钾来表征各修饰电极，结果如图3 所示。曲线a 为裸玻碳电极，当电极表面修饰邻苯三酚膜后，峰电流显著增大，达180μA，表明修饰的邻苯三酚具有较大的比表面积和良好的导电性能（曲线b）。当甲霜灵印迹膜沉积到邻苯三酚电极表面，由于电极表面被一层致密的不导电膜覆盖，无传质通道，氧化还原峰消失（曲线c）。当用洗脱液去除模板分子后，由于膜中印迹孔穴的形成，探针可通过孔穴到达电极表面发生反应，从而峰电流重新增加（曲线d）。在曲线e 中，峰电流减小的原因是印迹膜再次吸附甲霜灵，使得传质通道被堵塞。而非印迹传感器由于不存在印迹孔穴，所以洗脱前（曲线f）、后（曲线g）均不存在氧化还原反应。

2.3 电化学传感器制备条件优化

2.3.1 聚合底液组成的影响及优化

单体种类及其与模板分子的浓度比对聚合膜性能有较大的影响[19]。本实验中对聚合底液中模板与单体的浓度比进行了优化。配制模板/单体摩尔比为1∶8，1∶12，1∶16，1∶20 和1∶24 的聚合底液制备系列传感器，结果（图4）表明，当模板/单体摩尔比为1∶16 时，传感器对8×10-6mol/L 甲霜灵有最大的响应电流。

2.3.2 电聚合次数的优化

电聚合过程中扫描次数对传感器的影响见图5。可以看出，聚合扫描20、30、40、50 和60 次的传感器对模板分子响应值先增大后减小，当扫描40次时响应电流最大。这可能是由于随着聚合次数的增加，分子印迹膜逐渐变厚，位于印迹膜内部的模板分子不能完全洗脱[20]，从而导致传感器的灵敏度降低。因此选择电聚合扫描次数为40 次。

图3 印迹传感器（A）和非印迹传感器（B）的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammograms of molecularly imprinted sensor（A）and non-imprinted sensor（B）

图4 模板/单体摩尔比对传感器响应电流的影响Fig.4 Effect of template/monomers ratio on response of sensor

图5 电聚合扫描次数对传感器响应电流的影响Fig.5 Effect of polymerization cycles on response of sensor

2.3.3 缓冲液pH 的影响

在苯酚浓度0.016 mol/L 条件下，改变聚合底液硼砂缓冲液的pH（7.1，8.0，8.4 和9.0），制备系列传感器，并用DPV 法考察传感器对甲霜灵的响应。结果（图6）表明，随着pH 的增大，传感器的响应值增加，当pH=9.0 时，制得的传感器对8×10-6mol/L 甲霜灵的响应电流最大，说明在此条件下，识别位点被占据较多，分子印迹效果较好。因此，选择pH=9.0 的硼砂缓冲液作为聚合基底液。

图6 硼砂缓冲液pH 对传感器响应电流的影响Fig.6 Effect of borax buffer solution pH on response of sensor

2.3.4 模板洗脱液及时间的确定

非共价型分子印迹聚合物模板去除中常用的洗脱剂是甲醇与乙酸的混合液，本实验中选取不同体积比（2∶1，3∶1，4∶1）的甲醇/乙酸来去除模板分子。结果表明：体积比为3∶1 的甲醇/乙酸去除模板效果最好；2∶1 的甲醇/乙酸难以洗脱模板；4∶1 的甲醇/乙酸会导致印迹膜轻微溶胀，导致印迹膜被破坏。因此选择3∶1 的甲醇/乙酸作为洗脱剂。

将传感器置于3∶1 的甲醇/乙酸中磁力搅拌洗脱后用水冲洗，再进行CV 扫描，结果表明，随着搅拌时间的增加，CV 峰电流不断升高。这是因为印迹膜中的甲霜灵不断被溶出，印迹孔穴增多，使到达电极表面的铁氰化钾探针增多。当洗脱时间超过20 min 后，CV 峰电流不再增加，说明印迹膜中的模板被全部去除。因此确定洗脱时间为20 min。

2.4 吸附时间的选择

考察了甲霜灵在印迹膜上的吸附时间对电极响应的影响。将传感器浸入8×10-6mol/L 甲霜灵待测液中，每隔20 s 用灵敏度较高的差示脉冲法扫描。结果表明，随着吸附时间的延长，电极响应值不断升高，当吸附时间为2 min 时响应值最高，说明印迹膜中甲霜灵印迹孔穴吸附趋于饱和。因此确定吸附时间为2 min。

2.5 传感器的性能研究

2.5.1 线性方程和检出限

在优化的实验条件下，考察印迹电极在铁氰化钾缓冲液中对不同浓度甲霜灵的DPV 响应曲线。结果（图7）表明，铁氰化钾峰电流随甲霜灵浓度的增加而逐渐降低，其峰电流的响应值Δip（铁氰化钾缓冲液中不含甲霜灵和含有甲霜灵时的峰电流之差与甲霜灵浓度c 在3.0×10-9～1.8×10-5mol/L范围内呈现良好的线性关系，回归方程为Δip=1.141 6+0.407c（R2= 0.996 8）。计算20 次空白实验的标准偏差Sb，以3Sb/k 为检出限（LOD），其中k 为

图7 甲霜灵印迹传感器在铁氰化钾缓冲液中对不同浓度甲霜灵的响应Fig.7 Response of metalaxyl imprinted sensor to metalaxyl at different concentrations in potassium ferricyanide buffer solution

工作曲线的斜率，则甲霜灵的检出限为1.01×10-9mol/L，经1.2.6 节公式（1）换算后为0.003 mg/kg。

采用相同的聚合方法在裸玻碳表面制备了甲霜灵印迹膜电极，并研究了此电极测定甲霜灵的线性范围和检出限。响应电流Δi 与甲霜灵的 浓 度c 在6.0×10-8～3.8×10-6mol/L 范 围 内 具 有良好的线性关系，回归方程为Δi=1.4+0.349c（R2=0.994 7），检出限为3.1×10-8mol/L（0.086 mg/kg）。综上可知，邻苯三酚的引入显著增加了传感器的灵敏度。

2.5.2 传感器的选择性、重复性和稳定性分子印迹膜对模板分子的选择性识别是印迹传感器的一个突出优点，这对于基质成分很复杂的烟草样品来说有非常重要的实际应用价值。在铁氰化钾缓冲液中测定了传感器对8.0×10-6mol/L甲霜灵的DPV 响应，以及含有可能会对烟草中甲霜灵测定产生影响的烯酰吗啉、氟吗啉、苯霜灵，空白烟草提取液、乐果和百菌清时的DPV 响应。由图8 可知，空白烟草提取液对测定有一定的干扰，但由于电流响应值超出该方法线性范围，因此可忽略不计。另外，10 倍浓度于甲霜灵的烯酰吗啉、氟吗啉和苯霜灵，50 倍浓度于甲霜灵的乐果和百菌清并未干扰甲霜灵的测定结果，说明印迹孔穴对甲霜灵的选择性较好。

图8 干扰物质对甲霜灵测定的影响Fig.8 Effect of interference material on determination of metalaxyl

用相同方法制备的5 支电极对相同浓度的甲霜灵进行测定，则相对标准偏差（RSD）为4.12%；

2.6 实际样品分析

将4 个烟草样品用该实验方法进行甲霜灵的检测，并进行加标回收实验。结果（表1）表明，电化学分析法测定结果的相对标准偏差为2.98%～4.26%，加标回收率为98.5%～113.7%，初步说明测定结果准确、可靠。

为进一步验证此传感器的测定结果，采用行业标准方法LC-MS/MS 法测定4 个烟草样品中的甲霜灵，结果见表2。通过T 检验比较两组数据，P值＞0.05，说明在95%置信度下，两种方法测定结果无显著性差异。可见，本方法与LC-MS/MS 法的一致性较好。

表1 烟草样品中甲霜灵的测定结果（n=5）Tab.1 Determination results of metalaxyl in tobacco samples（n=5）

表2 本方法与液相串联质谱法的比对实验结果（n=5）Tab.2 Results of comparison experiment between this method and LC-MS/MS（n=5） (mg·kg-1)

3 结论

以甲霜灵为模板，苯酚为功能单体，在聚邻苯三酚修饰的玻碳电极表面成功制备了一种能简单快速灵敏准确检测烟草农残甲霜灵的分子印迹传感器。本方法克服了行业标准中仪器昂贵、分析时间长、样品前处理较为繁琐等不足，定量结果准确可靠。方法的检出限为0.003 mg/kg，加标回收率为98.5%～113.7%，RSD 为2.98%～4.26%。本方法应用简单、测定快速、结果准确、选择性强、灵敏度高，适用于烟草农残甲霜灵的检测。