miR-96-5p靶向FOXO1调节成骨细胞衰老的作用

鲁晴 谭海涛 韦灿燊 程志琳 张光文梁家敏 彭贾贾 罗雪文 黎静

1广西医科大学基础医学院生理学教研室（南宁530021）；2广西医科大学第八附属医院，广西数字医学3D打印临床研究中心（广西贵港537100）

伴随着人口数量的增长和生活水平的不断提升，老年人口的数量不断增长，衰老性疾病的发生率正处于持续上升状态。原发性骨质疏松症作为一种与增龄性相关的退行性疾病，已成为困扰众多家庭老年人健康的重要疾病之一［1］。成骨细胞是参与骨形成的重要功能细胞，骨形成功能减退对骨质疏松以及骨折的发生有着重要影响［2］。miRNA长度约20 ～25 个核苷酸，是一系列具有调控功能的内源性非编码RNA。它在调节细胞增殖、凋亡、分化等过程中均起着重要作用。已有研究［3］表明多种miRNA 参与骨质疏松的发病过程，对成骨细胞的调节起着重要作用。

大量研究表明随年龄增长的退行性变化是由自由基活性氧氧化损伤作用所致。而大剂量D-半乳糖可使体内产生大量超氧阴离子自由基并对组织产生过氧化损害，这种生化和组织结构的改变与自然衰老表现吻合［4］。因此，采用D-半乳糖制备衰老模型的方法是目前国际上公认的衰老模型制作方法。笔者使用D-半乳糖进行衰老小鼠模型制备，前期研究通过芯片分析，发现一些在衰老小鼠骨组织中差异表达的miRNA，其中，miR-96-5p 在衰老骨组织中呈显著下调趋势，且国外有研究［5］表明，miR-96-5p 通过抑制表皮生成因子受体信号通路促进成骨分化，是成骨细胞的正调控因子。本研究旨在探讨miR-96-5p 调节成骨细胞衰老的作用及其机制，为老年性骨质疏松症的预防和治疗挖掘新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料6～8 周昆明种小鼠20 只，雄性（广西医科大学实验动物中心提供）。原代成骨细胞取自出生5 ～7 d 乳鼠颅顶骨的成骨细胞。μCT 检测（广州，中国）MEM α 培养基（美国hyclone 公司），胶原酶Ⅱ型（sigma 公司），BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒（上海碧云天公司），PBS（北京索莱宝科技有限公司），胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）（北京索莱宝科技有限公司），β-半乳糖苷酶细胞衰老染色试剂盒（上海碧云天公司），Hoechst33258 染色液（上海碧云天公司），D-（+）半乳糖（北京索莱宝科技有限公司），cDNA 逆转录试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司），miRNA cDNA 逆转录试剂盒（上海生物工程有限公司），miR-96-5p 模拟物/抑制物、riboFECT CP Transfection Kit（广州锐博生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 D-半乳糖致衰小鼠模型的建立20 只6 ～8 周昆明种小鼠随机分为青年对照组、衰老模型组，每组10 只。按照相关文献［6］，衰老模型组每日上午颈背部皮下注射D-半乳糖200 mg/kg，连续12 周。青年对照组每日颈背部皮下注射相同剂量的生理盐水。

1.2.2 骨组织μCT 分析12 周后，处死小鼠，取小鼠左侧胫骨，10%福尔马林固定后，μCT（μCTSharp ZKKS-MCT，广州，中国）进行成像扫描。测量参数包括：（1）骨体积（BV/TV）：测量范围内骨小梁体积占全部骨组织体积的百分比，反映骨小梁分布密度；（2）骨小梁厚度（Tb.Th）：骨小梁面积/骨小梁周长）；（3）骨小梁密度（Tb.N）：（骨小梁周长/骨小梁面积）；（4）骨小梁分离度（Tb.Sp）：［总面积-骨小梁面积］/骨小梁周长。

1.2.3 成骨细胞衰老模型的建立按照相关文献［7］，取出生后5 ～7 d的昆明乳鼠，分离颅骨获得原代成骨细胞。将生长状态良好的小鼠成骨细胞接种于6 孔板。待细胞融合70% ～80%，给予含有浓度为20 g/L的D-半乳糖的完全培养基培养48 h，以建立成骨细胞衰老模型。

1.2.4 β-半乳糖苷酶染色吸除细胞培养液，用PBS 清洗1 次，加入β-半乳糖苷酶1 mL 染色固定液，室温固定15 min；吸除固定液，PBS 清洗，每孔加入1 mL 染色工作液，放置于37 ℃恒温箱中孵育过夜。甘油封闭镜下观察，β-半乳糖苷酶染色后，衰老细胞呈深蓝色，阴性细胞无着色。各组随机计数100 个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞率（%）。

1.2.5 细胞凋亡染色细胞生长约50%～80%满后，吸弃旧的培养基，加入0.5 mL 固定液，固定10 min。去固定液后用PBS 清洗，加入0.5 mL Hoechst33258染色液，5 min 后去染色液，用PBS 清洗。滴加抗荧光淬灭封片液，荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。各组随机计数100 个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞率（%）。

1.2.6 miR-96-5p mimic 及inhibitor 转染细胞细胞传代培养至细胞对数生长期接种于六孔板中，随机分为实验组和对照组，待细胞生长密度达到30%～50%时按照riboFECT cp 转染试剂说明书操作，每孔转染物终浓度为50 nmol/L，转染完成后将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养48 h。

1.2.7 Real time PCR（qRT-PCR）法检测miR-96-5p 表达Trizol 法提取组织和细胞总RNA 并进行逆转录，采用荧光定量染料法检测miRNA 表达水平（引物见表1）。表达水平每个样本重复测量3 次。以U6 为miRNA 内参参照标准，按照2-△△Ct计算基因相对表达量。

1.2.8 qRT-PCR法检测骨形态发生蛋白2（BMP2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、FOXO1基因表达细胞处理后，Trizol 法提取细胞总RNA并进行逆转录，采用荧光定量染料法检测各组基因表达水平（引物信息见表1）。每个样本重复测量3 次，以GAPDH 为基因内参参照标准，按照2-△△Ct计算基因相对表达量。

1.3 统计学方法使用SPSS 17.0 统计软件来进行数据分析。实验结果数据使用均数±标准差表示其集中趋势。两组间比较使用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 结果

2.1 骨组织μCT 分析及成骨细胞半乳糖苷酶染色衰老模型组在BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD 上明显低于对照组（P＜0.01，表2）。β-半乳糖苷酶染色实验表明，D-gal 处理后衰老成骨细胞阳性细胞数量显著高于对照组（P＜0.01，图1A、B）。

表2 各组胫骨骨组织计量分析Tab.2 Quantitative analysis of tibia bone tissue in each group ±s

表2 各组胫骨骨组织计量分析Tab.2 Quantitative analysis of tibia bone tissue in each group ±s

注：与对照组比较，*P ＜0.01

组别对照组衰老组BV/TV 39.77±2.28 27.35±4.91*Tb.N 5.84±0.30 5.13±0.28*Tb.Th 67.34±5.87 54.43±4.76*BMD 313.44±23.94 242.25±32.20*

2.2 骨组织及成骨细胞中miRNA-96-5p 表达的变化与对照组比较，D-gal 诱导后衰老小鼠胫骨组织中miR-96-5p 表达显著低于对照组（P＜0.05，图2A）。与对照组比较，D-gal 衰老成骨细胞中miR-96-5p 表达显著低于对照组（P＜0.01，图2B）。

图1 对照组（Control）与衰老组（D-gal）成骨细胞β-半乳糖苷酶染色情况分析Fig.1 Analysis of β-galactosidase staining of osteoblasts in the control group and aging group

图2 对照组（Control）与衰老组（D-gal）骨组织及成骨细胞中miRNA-96-5p 表达情况Fig.2 MiRNA-96-5p expression in bone tissue and osteoblasts in the control and aging groups

2.3 miR-96-5p mimic 及inhibitor 处理成骨细胞后miR-96-5p的表达为进一步探讨miR-96-5p的生物学功能，笔者采用miR-96-5p mimic（过表达）及miR-96-5p inhibitor（抑制）转染成骨细胞。结果显示，miR-96-5p mimic 转染成骨细胞后，细胞miR-96-5p 表达较阴性对照组表达显著升高（P＜0.01，图3A）。miR-96-5p inhibitor 转染成骨细胞48 h 后，细胞miR-96-5p 表达较阴性对照组表达显著降低（P＜0.05，图3B）。

2.4 miR-96-5p对成骨细胞衰老的影响作用β-半乳糖苷酶染色实验表明，与对照组比较，miR-96-5p mimic 转染后细胞阳性数量差异无统计学意义，但是miR-96-5p-inhibitor 转染后增加衰老阳性细胞数量（P＜0.05，图4、5）。

2.5 miR-96-5p 对成骨细胞凋亡的影响Hoechst 33258 染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡的细胞核会呈现致密浓染，或呈碎块状致密浓染（图6）。实验结果表明，miR-96-5p mimic 转染细胞后，成骨细胞的凋亡百分比与对照组无显著差异；而miR-96-5p inhibitor转染成骨细胞后，成骨细胞凋亡细胞百分比显著高于对照组（图6、7，P＜0.01）。

图3 miRNA-96-5p mimic/inhibitor 处理后成骨细胞miR-96-5p 表达情况Fig.3 Expression of miR-96-5p in osteoblasts after treatment with miRNA-96-5p mimic/inhibitor

2.6 miR-96-5p 对成骨细胞ALP、BMP2 mRNA表达的影响为探讨miRNA-96-5p mimic/inhibitor转染后成骨细胞中骨形成相关指标的变化，采用qRT-PCR 检测ALP、BMP2 表达基因在细胞中的表达。与对照组比较，miR-96-5p mimic干预后，成骨细胞中ALP、BMP2 基因表达显著升高（图8A，P＜0.01）。而miR-96-5p inhibitor 转染后细胞中ALP、BMP2 基因表达显著降低（图8B，P＜0.05）。

图4 miRNA-96-5p mimic/inhibitor 处理后成骨细胞β-半乳糖苷酶衰老染色情况（100×）Fig.4 Aging staining of β-galactosidase in osteoblasts after treatment with miRNA-96-5p mimic/inhibitor（100×）

图5 miRNA-96-5p mimic/inhibitor 处理后成骨细胞后衰老染色阳性细胞数分析Fig.5 Analysis of the number of senescent positive cells after treatment with miRNA-96-5p mimic/inhibitor

2.7 miR-96-5p的靶基因预测通过生物信息学软件Targetscan 对miR-96-5p的靶基因进行预测分析，分析结果表明，miR-96-5p 可与FOXO1的3′-UTR 靶向结合（图9）。

2.8 miR-96-5p 对成骨细胞FOXO1 mRNA 表达的影响采用qRT-PCR 检测miRNA-96-5p mimic/inhibitor 处理后成骨细胞中FOXO1 mRNA 基因的表达情况，结果显示，与对照组相比，miRNA-96-5p mimic 组FOXO1 mRNA 表达显著下降（P＜0.01，图10A），miRNA-96-5p inhibitor 组FOXO1 mRNA 表达水平显著上调（P＜0.01，图10B）。

图6 miRNA-96-5p mimic/inhibitor 处理后成骨细胞Hoechst 染色情况（×100）Fig.6 Hoechst staining of osteoblasts after treatment with miRNA-96-5p mimic/inhibitor（×100）

图7 miRNA-96-5p mimic/inhibitor 处理后成骨细胞Hoechst染色凋亡细胞数分析Fig.7 Analysis of apoptotic cells after Hoechst staining of osteoblasts after treatment with miRNA-96-5p mimic/inhibitor

图8 miRNA-96-5p mimic/inhibitor 处理后成骨细胞相关基因表达的变化Fig.8 Changes of expression of related genes in osteoblasts after treatment with mirna-96-5p mimic/inhibitor

图9 miR-96-5p的靶基因预测结合位点Fig.9 Target genes of mir-96-5p predicted binding sites

图10 不同处理后成骨细胞基因FOXO1 表达的变化Fig.10 Changes in the expression of FOXO1 gene in osteoblasts after different treatments

2.9 D-gal 处理成骨细胞后FOXO1 mRNA 表达的变化为探讨衰老成骨细胞中FOXO1 mRNA 基因的表达情况，采用qRT-PCR 检测基因在细胞中的表达。结果显示，经D-gal 处理48 h 后，与对照组比较FOXO1表达水平显著上调（P＜0.01，图11）。

图11 D-gal 处理48 h 后成骨细胞基因FOXO1 mRNA 表达的变化Fig.11 Changes of FOXO1 mRNA expression in osteoblasts after D-gal treatment for 48 h

3 讨论

增龄过程中成骨细胞的衰老退行性改变是导致老年人骨质疏松症的关键因素之一，衰老受多种因素调控，目前为大众所广泛接受的是氧化应激学说，即衰老生命体中自由基代谢失衡导致机体组织受损，研究表明大量D-半乳糖进入机体后由于干扰正常代谢会导致自由基失衡使组织器官进入衰老状态［4］。本研究通过D-半乳糖法建立衰老小鼠模型和衰老成骨细胞模型后，使衰老小鼠胫骨组织BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD水平显著降低，衰老成骨细胞β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数目也显著增多，这些结果提示D-半乳糖处理后骨组织和细胞均发生了衰老相关的病理生理变化。

miRNA 在基因调控中起着重要作用。miRNAs通过与靶mRNA的3′未翻译区的碱基配对负调控基因表达，并进一步诱导其降解或抑制其翻译，参与调控多种生物学过程，包括细胞的分化、增殖、凋亡和发育等，是细胞增殖分化中的重要因子［3］。研究［8］发现，miRNA 可参与调控骨组织稳态，在骨生长发育，骨代谢以及骨细胞增生分化等过程中均发挥着重要调控作用。例如，miR-214 通过抑制ATF4（activating transcriptional factor 4）基因表达抑制成骨细胞MC3T3-E1的活性和骨形成；miR-146a通过靶向抑制人间充质干细胞JMJD3（jumonji domain containing 3），从而抑制成骨分化［5］。相关临床研究还发现miR-96-5p 在绝经后股骨头坏死患者的骨组织中下调表达，其表达异常可能是股骨头坏死的一个重要机制［9］。本研究发现，D-半乳糖诱导衰老的雄性小鼠骨组织及成骨细胞中miR-96-5p的表达均显著降低，提示miR-96-5p 还可能是调节成骨细胞衰老的重要因素。

衰老细胞死亡的实质就是细胞凋亡。细胞程序性死亡对衰老起主动作用，并引起特征性形态改变及衰老性生长停滞［10］。细胞凋亡也是调节成骨细胞稳态的重要因素。随着年龄的增加，成骨细胞的凋亡数量增加从而使成骨细胞的数量和活性降低，最终导致骨形成减少。成骨细胞凋亡在骨质疏松症的发病过程中起着非常重要的作用［11］。本研究中，抑制成骨细胞miR-96-5p的表达不仅可以增加成骨细胞凋亡的数量，也可以加剧成骨细胞衰老的程度，该结果提示miR-96-5p 具有调节成骨细胞衰老的作用，其作用可能与促进成骨细胞凋亡有关。

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，对合成骨基质、分泌相关物质及骨组织矿化等方面起到重要作用［12］。成骨细胞分化过程中，细胞因子起到了关键性的作用。其中ALP 是成骨细胞增殖分化的重要指标，对骨组织的产生和重建起着重要作用［12］。BMP-2 可以促进骨生成和诱导成骨细胞分化，在成骨细胞分化和骨形成过程中也起着重要的作用［12］。本研究中，抑制成骨细胞miR-96-5p的表达可导致骨分化因子ALP 及BMP-2 mRNA 显著下调，进一步提示miR-96-5p 促进成骨细胞衰老导致了骨分化程度降低，miR-96-5p 可能是调节衰老成骨细胞退行性改变的重要因子。

miRNA 可通过调控靶基因发挥不同的生物学功能。FOXO1 是叉头转录因子家族中的一员，能够参与调节细胞增殖、细胞内氧化应激机体能量代谢及众多生物学过程，同时也参与调节成骨细胞合成新骨，破骨细胞吸收矿化骨质，起着影响骨代谢，调控生物体骨量的作用［13］。本研究通过TargetScan 软件预测到FOXO1 mRNA的启动子区有miR-96-5p的结合位点。进一步实验证实，miR-96-5pmimic 干预成骨细胞后可以显著降低细胞中FOXO1 mRNA 表达，miR-96-5pinhibitor 干预后可以显著升高细胞中FOXO1 mRNA 表达，同时，FOXO1 mRNA 在衰老成骨细胞中也是显著高于对照组。这些结果提示，miR-96-5p 很可能通过靶向调节FOXO1 mRNA 来影响成骨细胞的衰老过程。尽管有些研究表明，FOXO1的高表达可通过降低成骨细胞内的氧化应激，对骨的形成具有一定的促进作用［14］。然而也有研究认为，FOXO1 对骨形成代谢起到了负反馈调节的作用。在成骨细胞前体细胞和脂肪细胞中敲除掉FOXO1 转录因子可以通过激活WNT 信号通路，提高成骨细胞的数量和骨基质的量［15］。还有研究表明，miR-96-5p 可通过激活Wnt/β-catenin 通路来调控胶质瘤细胞的增殖［4］。因此，miR-96-5p是否可通过调控FOXO1抑制WNT信号通路，从而促进衰老成骨细胞的退行性改变，其具体分子机制需要进一步研究。

综上所述，衰老过程中miR-96-5p 在衰老骨组织和成骨细胞中低表达，miR-96-5p 可能通过负调控FOXO1 影响成骨细胞的衰老进程，其具体分子机制有待进一步研究。本研究结果为研究增龄性骨退行性变的分子机制提供新的理论基础，为骨质疏松症的治疗提供新的干预靶点。