传染性法氏囊病病毒结构的冷冻电镜初步分析

苗苗，徐彩煌，黄子惠，张小东，张兴*，吴永平*

（1.浙江大学医学院生物物理系，杭州 310058；2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院病理科，杭州 310058；3.浙江大学冷冻电镜中心，杭州 310058；4.浙江农林大学动物科技学院，杭州 311300）

传染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）已遍布全球各地的养禽地区[1]。传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）是IBD的病原，导致机体产生免疫抑制[2-3]。IBDV属于双RNA病毒科，禽双RNA病毒属，其基因组由A、B双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）节段组成，全长约6.0 kbp，其中A节段（约3.2 kbp）含有2个部分折叠的开放阅读框（open reading frame,ORF）：大ORF编码一个110 kDa的多聚蛋白前体（pVP2-VP4-VP3），可自行加工成为2个结构蛋白VP2、VP3及一个丝氨酸蛋白酶VP4；小ORF编码一个17 kDa的非结构蛋白VP5。VP2是病毒的主要保护性抗原和主要结构蛋白，与中和抗体的诱导和识别、病毒粒子毒力的变异、细胞凋亡的诱导、抗原漂移和细胞嗜性有很大的关系[4]。VP3是一个多功能蛋白，其作用主要包括：1）在病毒装配过程中作为支架蛋白和招募病毒蛋白VP1进入病毒粒子；2）与病毒基因组RNA作用；3）调节VP1的活性；4）抗细胞凋亡[5]。VP5蛋白不是病毒复制的必需蛋白，但在病毒的传播和发病机制中有重要作用[6-7]。B节段dsRNA（约2.8 kbp）编码一个约90 kDa的VP1蛋白——RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）[8]，RdRp与病毒dsRNA结合，负责病毒基因组的转录和复制[9]。

dsRNA病毒的宿主范围广，从细菌到人类，分为7科（呼肠孤病毒科、金色病毒科、囊状噬菌体科、双RNA病毒科、小双RNA病毒科、双分病毒科和全病毒科）。dsRNA病毒基因组包含的RNA片段数目不一，从全病毒科仅包含1个RNA片段到一些轮状病毒中包含12个RNA片段[10]。目前，关于dsRNA病毒内部基因组的组装方式已有报道[11-12]。LUQUE等[13]发现，IBDV颗粒可以包装超过1个完整的基因组，且具有更大基因组拷贝数的IBDV颗粒具有更高的感染率，表明IBDV具有与其他dsRNA病毒完全不同的基因组包装和复制策略。但目前关于IBDV结构的研究主要集中在其蛋白衣壳方面[14-16]，仅获得了IBDV衣壳蛋白的晶体结构[9]，其基因组在其衣壳内部的包装方式和结构还不清楚。本文通过感染DF-1细胞获取IBDV，利用冷冻电镜三维重构技术获得了中等分辨率的IBDV三维结构。结果表明，IBDV与其他dsRNA病毒如呼肠孤病毒科胞质型多角体病毒（cytoplasmic polyhedrosis virus,CPV）[12]、蓝舌病毒（bluetongue virus,BTV）[17]、轮状病毒（rotavirus,RV）[18]的三维结构明显不同，在IBDV衣壳内部未观察到dsRNA基因组和RNA聚合酶的电子密度，暗示IBDV的dsRNA基因组的包装、转录和复制可能不同于其他dsRNA病毒。该结果可为揭示IBDV的起源进化和致病的分子机制提供结构学信息。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及仪器

IBDV由山东农业大学崔治中教授提供；负染观察在FEI Tecnai G2 Spirit 120 kV透射电子显微镜下进行，冷冻样品检查在FEI Talos F200C 200 kV冷冻电镜下进行，冷冻样品用FEI Vitrobot装置制备，数据收集使用FEI Titan Krios 300 kV低温场发射透射电子显微镜；普通碳支持膜铜网购自北京中镜科仪技术有限公司；碳微阵列支持膜铜网购自德国Quantifoil公司；氧化石墨烯溶液购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 病毒培养及纯化

首先将IBDV株接种至DF-1细胞上，待出现明显的细胞病变时收获病毒。将收获的2 L IBDV上清液离心（5 000g，4 ℃，30 min），弃细胞碎片，然后加入500 mL 40%的聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）8000到病毒上清液中，于4℃条件下缓慢搅拌过夜，再经过1.6×104g、4 ℃离心1 h，去除上清液，收集IBDV沉淀。将沉淀用20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）悬浮后吹打混匀，用24%的蔗糖垫在1.05×105g、4℃条件下离心2 h后弃上清液，然后加入400 μL Tris-HCl（pH 7.4），于4℃条件下过夜，接着将病毒沉淀吹打混匀后加至碘克沙醇梯度溶液（10%、20%、30%、40%、55%）中，以2.1×105g、4 ℃离心4 h，最后使用注射器小心抽取出各梯度溶液中的病毒条带，并进行缓冲液置换，于4℃条件下保存。

1.3 间接免疫荧光试验

为检测分离纯化的IBDV颗粒是否完整、是否有感染性，通过间接免疫荧光试验（immunofluorescent assay,IFA）进行观察[6]。试验步骤大致如下：IBDV感染DF-1细胞后48 h，弃细胞培养基；用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）洗2次；加入100 μL等体积丙酮和甲醇的混合液，然后在－20℃条件下放置30 min；PBS清洗3次；用5%脱脂奶在37℃条件下封闭2 h；在抗VP5单抗中于37℃条件下孵育1 h；PBS清洗3次；在用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）标记的羊抗鼠IgG（1∶200）中于37 ℃条件下孵育1 h；PBS清洗3次；用10 μg/mL 4’，6-二 脒 基 -2-苯 基 吲 哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）于室温条件下染核5 min，然后用PBS清洗3次，在倒置显微镜下观察。

1.4 透射电镜负染色观察

吸取3 μL IBDV样品于普通碳支持膜铜网上，吸附1 min后，用滤纸将表面样品液滴吸干，随即用2%醋酸铀溶液染色3次（染色时间分别为10 s、10 s、1 min），然后用FEI Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜观察IBDV的形态结构。

1.5 冷冻样品制备及数据收集

使用FEI Vitrobot快速冷冻IBDV样品的方法如下：将Vitrobot样品室的湿度调至100%，吸取2.5 μL IBDV样品，滴加于铺有氧化石墨烯的Quantifoil（2/2）铜网上，使用Vitrobot滤纸吸7.5 s，除去多余的液体后快速落至液氮冷却的液态乙烷中；之后利用Titan Krios 300 kV电子显微镜和Gatan K2 Summit相机收集数据，放大倍数为1.8×104倍，对应的像素大小为1.634 Å；图像曝光时间6～8 s，总电子剂量≈50 e－/像素。用Motion Corr2矫正图像漂移。原始4K×4K图像经过2×2像素平均后产生2K×2K图像，对应的 像 素 大 小 为 3.268 Å，之 后 使 用 RELION[19]、cryoSPARC[20]等进行图像处理和三维重构，其中图像欠焦和像散用Gctf确定[21]，二维及三维分类后，最终选取5 493个病毒颗粒进行取向优化和三维重构。

2 结果

2.1 纯化的IBDV对DF-1细胞的感染

为检测纯化的IBDV是否为完整的病毒颗粒并具有感染性，应用间接IFA方法检测经纯化的IBDV感染的DF-1细胞与抗IBDV VP5单抗的反应性。如图1所示，在感染纯化的IBDV的DF-1细胞上瞬间表达的VP5蛋白与抗VP5单抗发生了特异性反应。该结果表明，纯化的IBDV能够感染DF-1细胞并复制和繁殖。

图1 间接免疫荧光试验检测纯化的IBDV病毒的感染性Fig.1 Infectivity assay of purified IBDV on DF-1 cells detected with indirect immunofluorescent assay

2.2 IBDV冷冻电镜结果

将IBDV样品经冷冻制样后，利用FEI Titan Krios 300 kV低温场发射电子显微镜收集数据。从IBDV的冷冻图像（图2A）中，可以清晰地观察到病毒的外部形态，样品有2种不同状态的病毒颗粒：大多数病毒颗粒为包装dsRNA基因组的完整病毒颗粒，少数为不含dsRNA的空病毒颗粒（图2A箭头所示）。利用cryoSPARC和RELION软件对采集的IBDV冷冻电镜数据处理分析后获得了≈6.6 Å分辨率的IBDV三维结构（图2B～C）。三维结构显示，病毒颗粒直径≈70 nm，病毒衣壳由VP2三聚体构成，同时，VP2形成了五聚体及六聚体2种多聚体形式。IBDV衣壳形成三角形剖分函数T=13的二十面体结构，与以前报道的IBDV结构[14]一致，也与BÖTTCHER等[16]用冷冻电镜做过的分辨率≈20 Å的IBDV的衣壳结构一致。IBDV衣壳由260个VP2三聚体组成，其中20个VP2三聚体位于3次轴上，称为“I3三聚体”，4个VP2三聚体组成一个大的三角形，称为“G4三角形”。“G4三角形”与“I3三聚体”组成了一个非对称单元，其中“I3三聚体”连接3个“G4三角形”组成二十面体的一个平面。将获得的电镜结构与IBDV晶体结构[14]比较，发现两者的大部分蛋白二级结构吻合很好（图2D～F）。

图2IBDV三维重构Fig.2 Three-dimensional reconstruction of IBDV by cryo-EM

2.3 IBDV与其他dsRNA病毒结构的比较

dsRNA病毒的三维结构已被广泛研究，包括衣壳和内部基因组结构。我们通过三维重构获得了生理状态下IBDV的三维结构，与其他已知dsRNA病毒结构如呼肠孤病毒科的胞质型多角体病毒（CPV）[12]、蓝舌病毒（BTV）[17]和轮状病毒（RV）[18]相比，在IBDV内部未观察到典型的≈20 Å的dsRNA特征密度，同时，在衣壳内表面的5次轴附近也没有观察到病毒RNA聚合酶的电子密度（图3A）。而作为对比，在其他3种dsRNA病毒结构内部都可以观察到明显的dsRNA及其聚合酶电子密度（图3B～D）。此外，IBDV的基因组密度也明显不同于其他dsRNA病毒。从表1可以看出：IBDV的衣壳内直径最大，约为54 nm，其他3种病毒为47～52 nm；IBDV基因组总长约为6.0 kbp，其他3种病毒分别为24.7、19.0和18.0 kbp；IBDV基因组密度约为0.072 bp/nm3，其他均约为0.3 bp/nm3，说明IBDV衣壳内基因组密度明显低于其他3个dsRNA病毒。这些差别暗示IBDV病毒在基因组包装、转录复制方面与其他dsRNA病毒不同。

图3IBDV与其他dsRNA病毒内部结构对比Fig.3 Difference between IBDV and three other dsRNAviruses at their central sections

表1IBDV与其他dsRNA病毒的比较Table 1 Comparison between IBDV and three other dsRNAviruses

3 讨论

为了避免病毒dsRNA在细胞质中引起宿主细胞产生抗病毒反应，dsRNA病毒必须把其dsRNA基因组片段保护在其衣壳内部，同时，每个dsRNA片段均包装一个核酸转录酶，并且这个核酸转录酶固定结合在衣壳内表面的5次轴附近。在感染宿主细胞期间，每条dsRNA片段均在病毒衣壳内部高效地独立进行转录复制，互不干扰。如在CPV、BTV和RV病毒衣壳内部分别包装了10、10和11条dsRNA片段和对应的核酸转录酶。但dsRNA病毒基因组片段是如何包装在衣壳内部以保证不同的病毒dsRNA基因组片段的有序转录的，一直是未解之谜。

IBDV病毒基因组比较简单，只有2条不同的dsRNA片段，因此很适合用于解析dsRNA病毒基因组是如何包装的秘密。尽管目前对于IBDV结构的研究已有很多，例如BÖTTCHER等[16]也用冷冻电镜做过IBDV的结构研究，但分辨率仅约为20 Å，同时该研究也没有报道衣壳内部基因组的结构信息，因此，关于IBDV衣壳内部dsRNA的结构信息知之甚少。本研究利用冷冻电镜单颗粒技术，获得了在生理状态下IBDV约6.6 Å分辨率的三维结构。但与其他已知结构的dsRNA病毒相比，在IBDV内部并未观察到特征性的dsRNA电子密度和RNA聚合酶电子密度。该结果可能存在2种原因：一是IBDV衣壳破裂，导致病毒dsRNA和RNA聚合酶从衣壳内部释放出来；二是IBDV基因组dsRNA可能存在与其他dsRNA病毒基因组完全不同的组装方式。由于在数据处理过程中，我们选择的是完整的、内部含有dsRNA基因组的病毒颗粒进行三维重构，同时，我们用纯化的IBDV病毒对DF-1细胞进行感染实验的结果表明，纯化的IBDV能够感染DF-1细胞并复制繁殖，说明纯化的IBDV病毒基因组具有完整性。因此，在IBDV衣壳内部观测不到dsRNA的最可能原因为后者，即IBDV的dsRNA基因组采取了与其他dsRNA病毒基因组完全不同的包装方式。根据LUQUE等[13]的发现，在IBDV内部可包装多于1个基因组拷贝，且基因组拷贝数与病毒的毒力相关。通过与3个dsRNA病毒衣壳内部体积、包装基因组数目及基因组包装密度对比，发现IBDV衣壳内基因组密度明显低于其他3个dsRNA病毒，衣壳内部可包装多个基因组。总之，本结果表明，IBDV基因组采用了与其他dsRNA病毒基因组不同的组装方式，暗示IBDV的起源和进化与其他已知基因结构的dsRNA病毒不同。该结果也说明，使用单颗粒冷冻电镜方法不能解析出IBDV病毒内部的三维结构，需要使用冷冻电子断层三维重构的方法来进行IBDV基因组的结构研究。

致谢 文中的实验数据收集自浙江大学冷冻电镜中心，谨致谢意！