中华绒螯蟹胚后发育生物学零度及其有效积温

王璞，马旭洲，温旭

（上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室/上海水产养殖工程技术研究中心/水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），又称大闸蟹或河蟹，隶属于节肢动物门（Arthropoda）甲壳纲（Crustacea）十足目（Decapoda）方蟹科（Grapsidae）绒螯蟹属（Eriocheir），是我国重要的水生经济动物[1]，以肉质鲜美、营养丰富、经济效益好等优点受到广大养殖户的青睐。近年来，随着人工育苗技术的推广，人工苗种产量逐渐增加，2017年全国中华绒螯蟹苗种产量已达843 890 kg[2]。温度是影响甲壳动物生长发育的重要环境因素之一[3]，一直是科学家研究的热点。目前，已对合浦绒螯蟹（Eriocheir hepuensis）卵和幼体发育的生长适温[4]，绒螯近方蟹（Hemigrapsus penicillatus）胚胎和幼体发育的积温[5]，梭子蟹（Portunus trituberculatus）、锯缘青蟹（Scylla serrata）胚胎发育温度[6-7]等进行了研究。

有效积温法则是温度与发育关系的直观体现[8]，生物学零度和有效积温是甲壳动物的重要生物学指标，不仅可以衡量水产动物对环境温度变化的响应，而且可为水产经济动物人工育苗的温度调控、发育历期提供重要参考。

中华绒螯蟹的整个生命周期分为胚前、胚胎和胚后3个发育阶段，其中胚后发育阶段又包括幼体、仔蟹、幼蟹和成蟹4个时期，幼体期（包括Ⅰ～Ⅴ期溞状幼体和M期大眼幼体）是中华绒螯蟹胚后发育的起始时期，对整个胚后阶段的健康发育具有决定性作用。目前，关于中华绒螯蟹生长发育温度的研究主要集中在胚胎发育阶段和胚后发育阶段的幼蟹时期，如不同水温对中华绒螯蟹胚胎发育阶段的影响[9]、中华绒螯蟹胚胎阶段有效积温和酶的关系[10]、河蟹早繁育苗胚胎发育积温的调控[11]、中华绒螯蟹幼蟹时期积温与生长的关系[12]等；但关于幼体时期生物学零度和有效积温的研究尚未见报道。

本研究拟采用室内水族箱培育和室外温度监测相结合的方式，定期观察、记录温度和发育历期数据，运用统计学方法对数据进行处理，探讨中华绒螯蟹溞状幼体的生物学零度、有效积温和发育历期并进行验证，以期为中华绒螯蟹人工育苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验地点

本实验地点位于江苏省盐城市射阳县黄三水产苗种培育有限公司（33°52′3.79″N，120°27′12.12″E），该基地拥有约46.67万m2天然海水人工生态育苗池塘，同时配有标准检测实验室。生态育苗池塘为注入天然海水的人工土池，规格统一为长45.0 m、宽30.0 m、塘深3.0 m，育苗期水深为1.5～2.0 m。

1.2 供试幼体

本实验幼体为随机采集的1 800只长江水系河蟹良种“江海21”Ⅰ期溞状幼体（由江苏省盐城市射阳县黄三水产苗种培育有限公司提供），幼体健康，活力旺盛。

1.3 生物学零度和有效积温实验设计

于2016年4月9日进行育苗塘抱卵蟹挂笼，然后每隔2 h进行采样观察，以Ⅰ期溞状幼体孵化超过60%为蟹苗取样时间。向9个经过消毒、容量为15 L，规格为40.0 cm×28.5 cm×16.5 cm的水族箱内各注入10 L经60目筛绢过滤的育苗池塘水，用DTC-120温度控制器（徐州欧诣电器有限公司）设置3个恒温处理组，分别为20、22和24℃，每个处理设置3个平行。各箱均放入随机取样的中华绒螯蟹Ⅰ期溞状幼体200只，以LP-40型RESUN超静音增氧泵（深圳市兴日生实业有限公司）进行微充氧，以保证实验期间水体溶氧量不低于5 mg/L。

另取水族箱6个，分别加入7.5 L育苗池塘水，分为3组，环境条件设置与处理组一致。以备换水使用。

生物学零度和有效积温实验历经22 d。每天8：00和17：00按照《河蟹生态养殖》（第2版）[1]进行投喂，其中：Ⅰ期溞状幼体投喂小球藻，发育至Ⅱ期溞状幼体时开始投喂轮虫，发育至Ⅴ期溞状幼体时开始投喂卤虫。每天6：00进行吸污，每2天换水一次，每次换水5 L，吸污和换水采用SC-002型换水器（广东博宇水族实业有限公司）。每天6：00、10：00、16：00和20：00进行观察，使用YSI550A便携式溶氧仪（美国YSI公司）监测溶氧和实时水温，并按照《河蟹生态养殖》（第2版）[1]所述方法观察河蟹溞状幼体外观以判断发育期，记录各处理的发育情况，确认每次变态达到60%的时间点。取4次温度的平均值为该处理组当日的发育平均温度，取实验期内该处理组所有日期发育平均温度的平均值为该处理组发育平均温度。

1.4 历史监测数据

由于室内实验是在实验室恒温条件下设计的，所以为了增加实验结果的可信性，采用基地历史监测数据进行比较。基地历史数据监测时间为2012—2016年每年的4月和5月，在射阳实验基地随机选取4口育苗塘，每口育苗塘四角及中央处各插入一根竹竿，用防水材料固定一台RC-4温度记录仪（江苏省精创电气股份有限公司）在竹竿上，用皮套固定外置传感器，记录水面下100 cm处的水温，设置记录间隔为15 min。实验塘饵料参照《河蟹生态养殖》（第2版）[1]，结合育苗实际情况投喂。于每天6：00、10：00、16：00和20：00进行4次观察，记录各发育期天数。在M期大眼幼体变态完成时回收温度记录仪，取其中Ⅰ期溞状幼体变态60%至大眼幼体变态60%的数据作为基地历史监测数据。

1.5 监测指标

记录室内实验期内各处理、各重复的日平均温度、幼体时期的各发育天数。历史监测数据记录育苗期每年日平均温度、幼体阶段的各发育天数。

1.6 数据计算

根据有效积温法则K=N(T－C)[13]，借助最小二乘法推导出室内生物学零度和有效积温实验数据的计算公式：

式中：K为有效积温，℃·d；N为溞状幼体发育需要的时间，d；T为发育期平均水温，℃；C为生物学零度，℃；V为发育速率（V=1/N）；n为处理组数，本实验处理组数为3。

历史监测数据实验中有效积温的计算方法为：首先将2012—2016年每年室外生态育苗塘育苗期的平均温度和发育历期数据代入式（1），计算出每年的生物学零度，然后将2012—2016年每年室外育苗塘各期平均温度、各期发育天数代入式（2）中，计算出各期有效积温，再利用公式进行加和，获得当年育苗期总有效积温。式中：K1为幼体Ⅰ期发育有效积温，Kn为幼体第n期发育有效积温，以此类推，∑K为各期发育有效积温的累积值，即当年育苗期总有效积温。

1.7 数据处理方法

利用Excel 2010软件对实验数据进行计算，利用SPSS 19.0软件对计算结果进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采用最小显著性差异法（least significant difference,LSD）对不同处理和不同年份的样本平均数进行差异显著性分析，置信区间为95%。统计结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

将3个处理的发育时间和平均水温代入公式（1）和（2）中，得出生物学零度为6.91℃，有效积温为274.18 ℃·d

从3个处理的发育时间、平均水温及有效积温的计算结果（表1）可以看出，温度对中华绒螯蟹幼体的发育天数有明显影响，中华绒螯蟹幼体的发育天数随着温度的升高明显缩短。对幼体时期有效积温进行验算，将上面计算所得的生物学零度6.91℃代入式（2），并进行差异显著性分析。结果表明，3个实验温度组验算结果显示有效积温的平均值为274.18℃，与实验计算结果274.18℃一致，且各实验温度组间差异均不显著（P＞0.05）（表1）。

使用历史监测数据计算2012—2016年自然温度条件下各发育期有效积温和当年各发育期的有效积温之和，可见各个相邻发育期的有效积温比较接近（表2）。

表1 3个处理的发育历期、平均水温及有效积温Table 1 Development period,average water temperature and effective accumulated temperature of three treatments

表2 2012—2016年自然温度条件下各发育期有效积温Table 2 Effective accumulated temperature of each period under natural temperature condition from 2012 to 2016 ℃

将生物学零度C=6.91℃代入有效积温验算公式K=N(T－C)，对2012—2016各年有效积温进行验算，并与室内实验有效积温数据进行差异显著性分析。结果发现，差异均不显著（P＞0.05）（表3）。综上表明，中华绒螯蟹溞状幼体阶段的生物学零度为6.91℃，有效积温为274.18℃·d。

表3 2012—2016年自然温度条件下有效积温计算及差异显著性分析结果Table 3 Calculation of effective accumulated temperature under natural temperature condition and results of significant difference analysis from 2012 to 2016

3 讨论与结论

3.1 与其他相近研究的异同点

生物学零度和有效积温研究在农林业上应用较广，相近研究均遵循有效积温法则，如用于昆虫的病害防治[14]，确定植物种子萌发及陆生、水生变温动物的发育期研究等。在农林业方面，研究了梨小食心虫（Grapholitha molesta）发育全世代的生物学零度和有效积温[15]，探讨了粤东6种菊科植物种子的生物学零度、有效积温和各自萌发历期对温度的响应[16]。水生变温动物生物学零度和有效积温研究通常根据对象、环境、用途的不同，设计研究周期、范围并选择其生活史中单独或者相邻阶段进行实验，如：对光棘球海胆（Strongylocentrous nudus）的研究选择了从受精卵发育至棱柱幼体阶段[17]，对中华锯齿米虾（Neocaridina denticulate sinensis）的研究选择了从受精卵发育至幼虾孵化阶段[18]，对三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和背瘤丽蚌（Lamprotula leai）的研究选择了从钩介幼虫发育至稚蚌阶段[19-20]，而对斑节对虾（Penaeus monodon）的研究则选择了溞状幼体和糠虾幼体阶段[21]。

3.2 幼体阶段有效积温、生物学零度和发育历期特点

由历史监测数据可见，每年孵化初期水温偏低，导致Ⅰ期溞状幼体所需发育积温较之Ⅱ期至Ⅲ期溞状幼体略高，Ⅱ期溞状幼体至大眼幼体期的有效积温均随幼体发育期的增加而呈逐渐上升趋势。黄晓荣等对中华绒螯蟹胚胎发育积温做了初步研究[10]，陈军伟等在黄晓荣等的研究基础上推算出中华绒螯蟹胚胎阶段生物学零度为5℃[12]，低于本文的幼体阶段生物学零度，说明生物学零度随发育阶段而上升。洪万树等发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期溞状幼体和MⅠ、MⅡ、MⅢ期糠虾幼体生物学零度间无显著差异[21]。可见，同一种生物相邻发育时段的生物学零度差别极小；本文研究结果与此相近。

3.3 幼体阶段影响生物学零度和有效积温的其他因素

科学研究表明，甲壳动物生物学零度和有效积温对繁殖水域时空变化存在响应：绒螯近方蟹（Hemigrapsus penicillatus）在5—9月高温季节繁殖旺盛，生物学零度达到12℃，其溞状幼体发育有效积温为226.35℃·d[5]；斑节对虾溞状幼体发育的生物学零度为13℃，这是由于斑节对虾生活在水温较高的亚热带水域，生长发育的环境温度较高[21]。而在本实验中，中华绒螯蟹的繁殖在沿海多风地区的春季进行，温度相对较低，生物学零度低至6.91℃，有效积温也累积到274.18℃·d。

本实验在室内恒温条件下进行，设置的温度虽不能完全反映室外育苗池塘的温度变化，但由于其他条件的设置都和室外育苗池塘相近，所以实验结果对于预测苗种上市日期有一定意义，可为中华绒螯蟹人工育苗研究提供科学依据。此外，本实验所用蟹苗限于长江水系，因而对长江水系中华绒螯蟹生产更具参考价值。