澄迈桥头地瓜组培苗快繁技术①

林 妃 李敬阳 何应对 王丽霞 黄东梅 殷晓敏 刘永霞 王必尊

(中国热带农业科学院海口实验站/海南省香蕉健康种苗繁育工程技术研究中心 海南海口571101)

地瓜又名白薯、甘薯、山芋、红芋、番薯、红薯，为旋花科甘薯属一年生或多年生蔓性草本植物，富含蛋白质、淀粉、果胶、纤维素及多种矿物质，有“长寿食品”之誉，是重要的粮食、饲料和工业原料用作物，在世界粮食生产总产量中排列第7位［1-3］。澄迈桥头富硒地瓜可以说是地瓜届的王者，它还有一个雅号—“长寿瓜”，其富含各种维生素、膳食纤维、淀粉、钾、钙等物质，营养丰富，甜度适中，且含硒元素特别高，可补虚、健脾、抗胃癌，是地瓜中的珍品，备受喜爱。

甘薯是中国重要的农作物，年产量仅次于水稻、小麦和玉米。然而，甘薯病毒病却一直影响着甘薯的产量，极大地阻碍了甘薯产业的发展，中国每年因甘薯病毒病造成的产量损失价值高达40亿元，此问题一直困扰着很多从事此方面研究的科技人员。甘薯病毒有多种，其中，甘薯卷叶病 毒 （sweetpotato leaf curl virus， 简 称SPLCV）是引起甘薯产量大幅降低的主要病原之一，SPLCV可引起甘薯叶片上卷、植株矮化等，在自然条件下由昆虫介体烟粉虱通过持久方式进行传播，也可通过嫁接方式进行传播［4-5］。

地瓜为无性繁殖作物，主要通过蔓秧、种薯和苗繁殖，病毒易在体内积累，从而逐年加重，造成减产，与其它无性繁殖作物一样，其产量受到病毒病的严重威胁。病毒病大田发病率达40%～60%，造成减产15%以上，严重时可达50%～80%，且有加重与蔓延的趋势［6～8］。目前对植物病毒病尚无有效的防治药剂，应用植物茎尖分生组织培养技术生产脱毒苗是防治病毒病最有效的途径。国内外的研究表明，甘薯通过茎尖培养获得脱毒苗，能显著提高产量［9-11］，增幅在 14.6%～43.4%［12］，并能改善块茎品质［13］和品种的特性。近年来，澄迈桥头地瓜由于受病毒病的影响，产量严重下降，旧地不能继续种植地瓜，大幅缩小桥头地瓜的种植面积。解决澄迈桥头地瓜种苗脱毒问题是确保地瓜产量提高的有效途径。试验选取海南省澄迈桥头地瓜作为供试品种，开展澄迈桥头富硒地瓜脱毒苗繁殖技术的研究，为澄迈桥头地瓜脱毒苗工厂化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验时间、地点

试验于2017年在中国热带农业科学院海口实验站热带植物繁殖技术研究中心进行。

1.1.2 试验材料

选取无病虫害、表面光滑无损伤的海南澄迈桥头富硒地瓜（简称桥头地瓜）为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体准备

将采回的桥头地瓜置于26℃左右环境下催芽，待芽萌发至5～8 cm时将芽剪下，剪去已展开的叶片，留下3 cm左右的顶芽。

1.2.2 外植体消毒

将顶芽用洗衣粉水清洗一遍，自来水冲洗30 min，置于无菌操作台备用。在无菌操作台上先用无菌水清洗2～4遍，把水倒干，放入75%酒精里不停摇晃1 min；用无菌水清洗2～4遍，再置于0、1‰、2‰、3‰的升汞溶液中浸泡15 min，不时摇晃，然后用无菌水清洗3～5遍，备用。

1.2.3 地瓜茎尖诱导培养

将消毒好的顶芽去掉叶片、茎段枝条，取茎尖生长点快速接种到含不同浓度激素的培养基诱导（表1）。以MS为基本培养基，分别添加不同浓度激素6-B、IBA，每种培养基接种50个外植体，置于26～30℃暗培养5 d，转为光照培养，每天光照12～14 h。

表1 不同茎尖诱导培养基配方

1.2.4 继代培养

将茎尖诱导出来的桥头地瓜脱毒苗用Frison等［14-15］的方法证明为无毒组培苗，将其作为继代培养材料。切取带芽的脱毒苗茎段接种到继代培养基中（配方为诱导茎尖筛选的培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L）；置于25～28℃条件下暗培养5～7 d，之后在光照14h/d、光强度1 500～1 800 lx条件下培养。

1.2.5 壮苗生根试验

待继代培养脱毒苗长至3 cm左右高时，切取单苗接种到含不同浓度激素的培养基上，置于光照16h/d、光强度1 500～1 800 lx条件下培养，观察桥头地瓜单芽在不同浓度激素中的壮苗生根情况。不同生根培养基以1/2 MS为基本培养基，分别添加0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA。

2 结果与分析

2.1 不同升汞浓度对桥头地瓜顶芽消毒的影响

由表2可见，2‰的升汞消毒效果最佳，其污染率最低（15%），褐化率较低（18%）；对照污染率100%；升汞浓度为1‰时褐化率最低，但是污染率达到65%；升汞浓度为3‰时污染率最低（10%），但褐化严重，达到63%。综合考虑，将2‰升汞浓度作为桥头地瓜外植体最适宜消毒浓度。

2.2 不同浓度6-BA对桥头地瓜茎尖诱导的影响

将消毒好的地瓜顶芽去掉多余的叶片及茎段，留取茎尖生长点，分别接种到A1、A2、A3和A4诱导培养基中，每天观察记录试验情况。第10天时A2和A3诱导出1～2个新芽，A1没有新芽，A4外植体周围有愈伤形成，A5外植体周围生成大量的愈伤。第15天时A1培养基中的外植体形成单芽，诱导率达到76%（表3）；A2培养基中的外植体长出1～5个新芽，诱导率达到83%；A3培养基中外植体诱导出5个以上的新芽，诱导率达到100%；A4培养基中外植体愈伤组织膨大，形成的丛生芽数量多，加上愈伤多，难以形成植株，诱导率只有43%；A5培养基中外植体形成大量愈伤并褐化，诱导率低，只有23%，难以形成植株（图1）。可见最适合地瓜茎尖诱导的培养基为A3，不加激素的情况下（对照）地瓜茎尖只有单芽形成，随着激素6-BA浓度的升高，诱导的丛生芽增多，而激素6-BA浓度过高时丛生芽虽多，愈伤也多，难以形成单芽植株。因此，并不是激素6-BA浓度越高越好。试验证明，最合适桥头地瓜茎尖诱导的培养基为A3。

表2 不同浓度升汞对茎尖消毒的影响

表3 不同浓度6-BA对桥头地瓜茎尖诱导的影响

图1 不同培养基诱导地瓜茎尖丛生芽

2.3 继代培养

将茎尖诱导出来的桥头地瓜组培苗用Frison等［14-15］的方法检验，证明其为无毒组培苗后，将其作为继代培养材料。切取小苗带芽茎段接种到继代培养基中，7 d左右有大量丛生芽形成，15 d左右长成3～5 cm的单个植株，即可用于生根培养。

2.4 不同浓度NAA对桥头地瓜组培苗壮苗生根的影响

诱导生根培养基以1/2 MS培养基为基本培养基，添加激素为NAA，设计4个浓度水平。地瓜为草本植物，生根容易。不添加激素的情况下（对照），地瓜组培苗也能生根，但生根时间长，10 d后才开始有根形成。添加激素NAA浓度为0.1 mg/L时，第3天就开始有根长出，7 d左右形成大量的根，苗粗壮，10～12 d就能连苗移栽；添加激素NAA浓度为0.2 mg/L时，3 d后有大量根长出，根的周围有愈伤形成，造成根的褐化；添加激素NAA浓度为0.3 mg/L时，5 d后才有根长出，根蓬松，愈伤多，褐化严重。试验结果表明，当添加激素NAA浓度为0.1 mg/L时最合适地瓜组培苗壮苗生根。

3 讨论与结论

本试验表明，地瓜组培苗在基础培养基1/2 MS中不添加激素也能生根，与刘玉敬等［5］报道（甘薯无毒苗快繁采用无生长调节剂的1/2 MS培养基培养就能顺利生长）相同。但是不加激素生根时间长，在添加激素NAA浓度为0.1 mg/L时最适合生根，生根时间短，第3天就有根形成，10～12 d就能连苗移栽，苗粗壮，根基部不形成愈伤；添加激素大于0.1 mg/L时基部有愈伤形成，影响生根时间及根数量，且根褐化。激素浓度越高愈伤越多，褐化越严重，这与前人研究结果相符，即激素浓度相对降低，可缩短了生根时间，且节约了生产成本，更有利于工厂化育苗。

本研究中，澄迈桥头地瓜茎尖诱导选择的激素组合为6-BA和IBA，这与顾淼［3］报道相同，只是所选择的浓度不同，获得的诱导率不一致，本研究缩短了茎尖的诱导时间，诱导率高、苗粗壮。本研究结果证明，用配方A3诱导桥头地瓜茎尖，15 d就能形成5个以上的芽，15 d诱导率达到100%，可用于继代或生根培养。激素6-BA浓度的高低对桥头地瓜茎尖生长点的诱导有很大的影响，不添加激素，只能诱导成单芽；6-BA浓度在0～2 mg/L，诱导率随着浓度的增大而提高，丛生芽数量增多，但是6-BA浓度大于2 mg/L时，诱导率随着激素6-BA浓度的增加反而减少，愈伤多，形成植株数量少。

通过对澄迈桥头地瓜茎尖进行诱导试验，获得了一套澄迈桥头地瓜脱毒组培苗快速繁殖方法：用2‰升汞对外植体进行消毒；茎尖生长点诱导不定芽的最适培养基配方为MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L；继代培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；最佳壮苗生根诱导培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg/L。