牦牛乳及其制品中苯甲酸来源分析及影响因素研究

余晓琴，李道霞，黄丽娟，唐昌云

（四川省食品药品检验检测院，四川成都610097）

苯甲酸（benzoic acid，BA）又称安息香酸[1]，在很多食品中天然存在，包括乳及乳制品[2-3]，研究表明原料乳中马尿酸在乳酸菌等微生物作用下转化为苯甲酸[4]。食品添加剂安全性评价的权威机构-联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会认为苯甲酸的每日允许摄入量为0～5.0 mg/kg 体重。安全剂量的苯甲酸不会对人体产生不利影响，但肝功能缺陷或衰弱者不宜多食用含苯甲酸的食品。不少文献曾报道普通奶牛牛乳及乳制品中苯甲酸与马尿酸的含量变化趋势[5-9]，但大部分研究缺少系统性的影响因素的验证。马尿酸（hippuric Acid，HA）又称苯甲酰甘氨酸、苯甲酰氨基乙酸，是食植动物代谢的副产物[7]，为牛乳中的天然成分，其浓度为30 mg/L～60 mg/L[8-10]。初步研究发现牦牛全脂乳粉中检出一定量的苯甲酸，而大部分样品高于文献报道[11]的普通奶牛全脂乳粉中苯甲酸的含量。牦牛乳及其制品作为高原地区牧民主要经济来源之一，具有极高的营养价值[12-13]。与规模化养殖相比，牦牛养殖以家庭分散经营、传统放牧模式为主，现代化程度低，奶牛食草为主，人工挤奶，无固定挤奶场地，挤奶场地缺少卫生保障措施等[14-15]，这些因素可能都会带来一定的影响。因此，为研究牦牛乳全脂乳粉中苯甲酸偏高这一关键问题，充分结合牦牛的生长环境、挤奶方式等特殊状态，建立牦牛乳及乳制品中马尿酸、苯甲酸测定方法，以该方法为基础检测牦牛乳及其制品中马尿酸、苯甲酸含量，分析马尿酸、苯甲酸含量转化关系，并研究二者转化的影响因素，为牦牛乳安全控制奠定研究基础，促进高原牦牛乳产业发展。

1 材料与方法

1.1 马尿酸、苯甲酸检测

1.1.1 主要仪器与试剂

1.1.1.1 仪器与试剂

UltiMate 3000 高效液相色谱仪：美国ThermoFisher Scientific 公司；Milli-Q 超纯水纯化系统：美国Millipore 公司）；Neofuge 23R 台式高速离心机：美国ThermoFisher Scientific 公司；涡旋混合器：德国IKA 公司；赛多利斯 TP-114 电子天平：美国 Sartorious 公司；0.45 μm PTFE 膜针头过滤器：美国 PALL 公司；0.45 μm PTFE滤膜：上海安普科学仪器有限公司；甲醇：色谱纯，德国Merck 公司；亚铁氰化钾（K4[Fe（CN）6]·3H2O）、乙酸锌（C4H6O4Zn·2H2O）、氢氧化钠（NaOH）、硫酸（H2SO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钾（K2HPO·43H2O）、磷酸（H3PO）4（以上均为分析纯）：天津科密欧公司；实验用水为二次蒸馏水；pH 试纸：上海馨晟试化工科技有限公司。

1.1.1.2 标准品

苯甲酸（纯度 99.5%）：Dr.Ehrenstorfer；马尿酸（纯度98%）：中国食品药品检定研究院。

1.1.2 标准溶液的配制

标准储备液：称取马尿酸、苯甲酸标准品50.0 mg、25.0 mg，分别置50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，4 ℃冷藏，有效期 3 个月。

混合标准溶液：使用甲醇水溶液（50/50，体积比）对标准储备液进行梯度稀释，得到系列混合标准溶液。

1.1.3 样品预处理

样品预处理参照国家食品安全标准乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定[16]，称取混匀液体样品10 g或固体样品1.0 g，精密称定，于100 mL 比色管中，加入25 mL 氢氧化钠溶液（0.1 mol/L），剧烈震摇5 min（或者超声处理5 min）。用硫酸溶液（0.5 mol/L）调节pH值至8 左右，依次加入2 mL 亚铁氰化钾溶液（92 g/L）和 2 mL 乙酸锌溶液（183 g/L），剧烈震摇 5 min（或者超声5 min），静置15 min，冷却至室温后，全部转移至100 mL 容量瓶中用甲醇溶液（50/50，体积比）定容至刻度，8 000 r/min 离心 10 min，上清液过 0.45 μm 滤膜。续滤液作为试样溶液，待高效液相色谱仪测定。

1.1.4 参考色谱条件

色谱柱：Agilent XDB C18（150 mm×4.6mm，5 μm）；流动相：甲醇：磷酸盐缓冲溶液（分别称取2.5 g 磷酸二氢钾和2.5 g 磷酸氢二钾于1 000 mL 容量瓶中，加900 mL 水溶解，磷酸调节pH 质至6.7，用水定容到刻度后混匀，用滤膜过滤后备用）=8∶92（体积比）；流速：1.0 mL/min；检测波长：227 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；分析时间：11 min。

1.2 试验用样品种类

牦牛乳（奶）（Yak milk）包括：乳头奶A（Nipple milk A）、乳头奶 B（Nipple milk B）、混合牦牛奶（Mixed yak milk）。牦牛乳制品包括：牦牛全脂乳粉（Yak whole milk powder）。

乳头奶A：直接从牦牛乳头采集的牛奶，一头奶牛为一个样本。采集方式：牧民佩戴无菌手套，挤奶前用75%消毒酒精分别对牦牛乳头及手套消毒三次，弃去前20 mL～30 mL 奶后，将后续牛奶接至经高压灭菌处理的玻璃容器中，加盖并封口。

乳头奶B：直接从牦牛乳头采集的牛奶，一头奶牛为一个样本。采集方式：根据牧民日常挤奶方式（未佩戴手套、未对乳头进行消毒、未去前20 mL～30 mL奶），将牛奶自乳头接至经高压灭菌处理的玻璃容器中，加盖并封口。

混合牦牛奶：牧民家存储桶或奶站存储桶里储存的混合奶，一个桶为一个样本。采集方式：从储奶桶直接转移至经高压灭菌的玻璃容器中，加盖并封口。

1.3 乳头奶A中马尿酸、苯甲酸检测

采用随机抽样的方法，共采集175 个乳头奶A 样品，测定牦牛乳中马尿酸和苯甲酸含量。

1.4 混合牦牛奶中马尿酸、苯甲酸检测

采用随机抽样的方法，采集10 个混合牦牛奶，测定牦牛乳中马尿酸和苯甲酸含量。

1.5 牦牛乳制品中马尿酸、苯甲酸检测

随机从超市购买19 批牦牛全脂乳粉进行检测。

1.6 牦牛乳中微生物检测（菌落总数）

参考GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》，检测乳头奶A（10 个）、乳头奶 B（10 个）、混合牦牛奶（10 个）中微生物情况。

1.7 乳头奶B中马尿酸、苯甲酸含量变化

根据牧民挤奶及储存牦牛乳的温度、时间等因素，将乳头奶 B（1 个）分为若干份，分别置 4、18、30 ℃保存，于 0、1、2、4、6、8、12、24、48、96 h 时检测其马尿酸、苯甲酸含量及其变化，考察温度、时间的影响。

1.8 灭菌与未灭菌乳头奶B中马尿酸、苯甲酸含量变化

乳头奶B（1 个）分为若干份，对部分进行灭菌处理，然后将灭菌、未灭菌样品置18 ℃保存，于不同时间点检测马尿酸、苯甲酸含量，考察微生物的影响。

2 结果与分析

2.1 马尿酸、苯甲酸检测

2.1.1 样品前处理的选择

参考食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定[16]，加入亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白后，将超声处理改为剧烈振摇，使该方法可用于牧场现场快速制样。

2.1.2 分析条件的选择

参考郭文丽等[17]研究，调整流动相中磷酸缓冲液比例及筛选磷酸盐缓冲液pH 值，最终确定以甲醇∶磷酸盐缓冲液=8∶92（体积比）（pH=6.7）作为流动相，马尿酸与苯甲酸能够得到有效分离，且不受其他物质干扰，如图 1～图3 所示。

2.1.3 线性方程与检测灵敏度

图1 试剂空白图谱Fig.1 Chromatogram of reagent blank

图2 马尿酸（0.844 μg/mL）、苯甲酸（1.979 3 μg/mL）标准品图谱Fig.2 Standard chromatograms of hippuric acid（0.844 μg/mL）and benzoic acid（1.979 3 μg/mL）

图3 牦牛全脂乳粉图谱Fig.3 Chromatogram of yak whole milk powder

以甲醇水溶液（50/50，体积比）稀释标准储备液得到马尿酸浓度为 0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，苯甲酸浓度为 0、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5 mg/L 的标准系列溶液，采用本方法进行测定。标准溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。采用标准溶液色谱峰的信噪比（S/N）≥3 作为检出限（limit of detection，LOD），结果见表 1。

表1 马尿酸、苯甲酸的线性范围、线性方程、相关系数（r）、检出限Table 1 Linear range，regression equations，correlation coefficients（r），LODs of HA and BA

结果表明，2 种化合物在设定的浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）大于0.999（见表1）。

2.1.4 准确度（添加回收率）与精密度

取已知含量的牦牛乳及牦牛全脂乳粉样品，分别做 0.5、1.0、20.0 mg/kg 浓度水平、6 平行的加标回收率实验，按照本方法进行前处理和进样分析，结果见表2。

表2 马尿酸、苯甲酸的平均回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of HA and BA（n=6）

由表2 可知，两种化合物的回收率为93.0 %～106.1%，RSD 不大于5.7%，说明该方法的精密度和准确度均较高。

2.2 牦牛乳及其制品中马尿酸、苯甲酸含量测定

2.2.1 乳头奶A 中马尿酸、苯甲酸含量测定

对175 个乳头奶A 检测结果如图4 所示。

图4 牦牛乳头奶中马尿酸含量Fig.4 Content of hippuric acid in yak nipple milk

结果表明，乳头奶中均未检出（测得含量低于方法检出限，not detected，ND）苯甲酸，马尿酸检出的含量范围为 22.71 mg/kg～79.73 mg/kg。

2.2.2 混合牦牛奶中马尿酸、苯甲酸含量测定

对10 个混合牦牛奶的检测结果表明，混合奶中苯甲酸含量在未检出至2.2 mg/kg 之间，马尿酸含量范围为 26.8 mg/kg～74.9 mg/kg，检测结果如表3 所示。

表3 混合牦牛乳中马尿酸、苯甲酸含量Table 3 Content of hippuric acid and benzoic acid in mixed yak milk

2.2.3 牦牛全脂乳粉中马尿酸、苯甲酸含量测定

对19 批市售牦牛全脂乳粉检测，结果见表4。

表4 牦牛全脂乳粉中马尿酸、苯甲酸含量Table 4 Content of hippuric acid and benzoic acid in yak whole milk powder

如表4 所示，在购买的19 批牦牛全脂奶粉中马尿酸含量范围为48.8 mg/kg～279.7 mg/kg，苯甲酸含量范围为 53.0 mg/kg～213.5 mg/kg。

2.3 乳头奶A、乳头奶B及混合牦牛奶中微生物检测

本研究中以菌落总数为代表反应牦牛乳中微生物污染情况，参考GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物检验菌落总数测定》分别检测乳头奶A、乳头奶B 及混合牦牛奶中微生物数量，结果如表5 所示。

表5 牦牛奶中菌落总数Table 5 Total number of colonies in yak milk

大部分样品中均含有一定量的微生物，其中乳头奶B 中微生物数量均显著高于乳头奶A，混合牦牛奶中微生物最多。

2.4 乳头奶B中马尿酸、苯甲酸含量变化及影响因素

在本研究中，将乳头奶B（NO.10，马尿酸含量为35.20 mg/kg，未检出苯甲酸，菌落总数为 1.3×105CFU/g）分为若干份，于不同条件下放置一定时间后分别检测其中马尿酸、苯甲酸含量，以研究牦牛乳中马尿酸、苯甲酸含量变化与时间、温度、微生物的关系。

2.4.1 温度、时间对乳头奶B 中马尿酸、苯甲酸含量变化的影响

取3 份样品，分别置不同温度条件下保存，于不同时间进行检测。温度、时间对牦牛乳中马尿酸、苯甲酸含量的影响如图5 所示。

图5 温度、时间影响牦牛乳中马尿酸、苯甲酸含量变化Fig.5 Effects of temperature and time on HA and BA in yak milk

在0～12 h 内，30 ℃条件下苯甲酸增加的趋势显著大于 4、18 ℃条件下，放置 12 h 后，30 ℃条件下的牦牛乳样品中未检出马尿酸，苯甲酸含量为20.85 mg/kg，之后苯甲酸含量趋于稳定。放置48 h 后，18 ℃条件下的牦牛乳样品中未检出马尿酸，苯甲酸含量为19.20 mg/kg。放置96 h 后，4 ℃条件下的牦牛乳样品中马尿酸含量为6.52 mg/kg，苯甲酸含量为16.94 mg/kg。结果显示，随着存放时间的延长，牦牛乳马尿酸含量逐渐降低，苯甲酸含量逐渐增加，且温度越高变化越快。

2.4.2 微生物对乳头奶B 中马尿酸、苯甲酸含量变化的影响

取4 份样品，对其中3 份进行灭菌处理（灭菌条件：95 ℃，30 min[18]），得灭菌（S）、未灭菌（N-S）两种样品，然后将4 份样品置18 ℃条件下保存。两种样品各取一份于不同时间进行检测，另外两份灭菌样品分别于24、96 h 时检测。结果见表6。

表6 微生物影响牦牛乳中马尿酸、苯甲酸含量变化（18 ℃）Table 6 Effects of microorganism on HA and BA in yak milk（18 ℃）

在0 h 时，灭菌、未灭菌牦牛乳样品菌落总数分别为＜10 CFU/g、1.3×105CFU/g。微生物对牦牛乳中马尿酸、苯甲酸含量的影响如表6 所示。与未灭菌样品相比，灭菌样品开封后96 h 内，马尿酸含量缓慢降低。而未开封的灭菌样品放置96 h 后马尿酸含量变化不显著，且未检出苯甲酸。结果显示，微生物含量较低时，即使延长放置时间，其马尿酸、苯甲酸含量变化不大，且灭菌后密封保存96 h，其马尿酸、苯甲酸含量几乎无变化。结合2.4.1 研究结果，说明与温度、放置时间相比，牦牛乳中微生物数量对放置过程中马尿酸、苯甲酸含量变化影响更大。

3 结论与讨论

1）本研究证实牦牛乳及其制品中苯甲酸主要是由天然马尿酸转化产生，微生物、温度及储存时间均是影响牦牛乳中马尿酸、苯甲酸含量变化的关键因素，其中微生物的影响更为主要。

2）牦牛的养殖主要为散养、奶牛以食草为主，人工挤奶、挤奶场所不固定、挤奶环境卫生控制的可能不理想，牧场和奶站等若缺乏有效的除菌设施，这些情况均易导致牦牛乳中微生物数量增加；另外，高原幅员辽阔，牦牛乳储存及运输过程中温度控制措施简单，易导致在该过程中微生物大量繁殖，进而引起牦牛乳中的马尿酸转化为苯甲酸，可能进一步导致牦牛乳制品中苯甲酸含量偏高。

3）本研究表明不同挤奶方式会导致牦牛奶中微生物数量差异，在挤奶前对牦牛乳头进行消毒，可有效降低牦牛乳头奶中微生物数量。储奶容器及储奶环境均会影响牦牛乳中微生物数量。