近红外光谱建模法快速测定桔子精油中柠檬烯的含量

陈梓云，彭梦侠，阮韵丹

（嘉应学院化学与环境学院，广东梅州514015）

柑橘皮通过冷榨法、蒸馏法、冷磨法、溶剂萃取法和超临界流体萃取法等方法，制得的具有独特的桔子皮味的精油称为桔子精油。常用作食品香精、化妆品香精和香水配料，此外，桔子精油清新的气味及镇静效果，有提振精神的作用，常用于平抚沮丧与焦虑；桔子精油可以调和肠胃、也能刺激肠胃蠕动、帮助排气，还能镇定消化道，增加胃口、刺激食欲，表现出良好的生理疗效[1-2]。决定桔子精油品质的主要成分是柠檬烯，还含有月桂烯、γ-萜品烯、α-蒎烯、佛术烯、芳樟醇、p-薄荷-1（7），2-二烯、香芹醇、a-松油醇等多种化合物[3]。造成桔子精油中主要成分含量差异的因素较多，如提取技术的差异、产地的差异等。快速有效地检测桔子精油的主要成分的含量，是推动精油市场良好发展的前提保障。

目前，检测桔子精油成分的方法是气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）[4-6]。检测时需要对样品进行前处理，消耗时间较长，因此无法达到快速无损检测的效果。近年来，近红外光谱法快速测定含量的研究越来越多，比如：蛹虫草中腺苷含量的测定[7]、八角茴香中莽草酸含量的测定[8]、罗布麻叶中总黄酮含量的测定[9]、新疆薰衣草精油主要组分的测定[10]、罗红霉素中两种主要成分的测定[11]及夏枯草中水溶性浸出物的含量的测定[12]等。

本文采用近红外光谱法（near infrared spectroscopy，NIR）结合化学计量学方法来建立了桔子精油快速定量的分析方法，能快速、有效地检测桔子精油中柠檬烯的含量，判别桔子精油的品质，对精油市场的有序发展具有很重要的现实意义和应用价值[13-16]。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与设备

Antaris II 型傅立叶变换近红外光谱仪：美国赛默飞公司；GCMS-QP2010 Ultra 型气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司。

1.2 试剂与样品

柠檬烯标准溶液（97%）：上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：广东光华科技股份有限公司。试验样品见表1。

表1 试验样品Table 1 Experimental sample

2 试验方法

2.1 GC-MS测定桔子精油中柠檬烯的含量

色谱条件：Rxi-5SilMS 石英毛细管色谱柱；升温程序：初始温度50 ℃，以5 ℃/min 升温至280 ℃并维持2 min；载气：99.999%He；柱流量 0.95 mL/min，吹扫流量1mL/min，压力49.5KPa，分流比100∶1；进样量：1μL。

质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；接口温度：280 ℃；电压：0.35 kV；质量扫描范围（m/z）：30～500，间隔 1 sec，扫描速度588，溶剂延迟 3.0 min。

用无水乙醇作溶剂，配制浓度分别为0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1 mg/L 的柠檬烯标准溶液。以特征离子（柠檬烯）峰面积为纵坐标，柠檬烯浓度为横坐标，绘制柠檬烯标准工作曲线见如图1。

图1 柠檬烯标准工作曲线Fig.1 Limonene standard working curve

该标准曲线的相关系数R=0.996 8，标准曲线线性关系良好，用于桔子精油中柠檬烯含量的外标法检测。

称取适量桔子精油样品，用无水乙醇稀释至1 mg/L。在色谱和质谱条件与制作柠檬烯标准曲线时的条件相同的情况下，测定J1～J10 桔子精油样品。根据待测样品桔子精油中柠檬烯的峰面积，即可在外标柠檬烯标准工作曲线上得出桔子精油中柠檬烯的含量。

2.2 桔子精油近红外光谱的采集

近红外光谱测定条件：以空气做背景，采用AntarisⅡ傅立叶近红外光谱仪的液体透射附件采样，使用6 mm 光程样品管，设置波数范围10 000 cm-1～4 000 cm-1，扫描次数 32 次，分辨率 8 cm-1。

取1 mL 桔子精油样品于液体样品管中，在同一环境温度湿度条件下，以空气为背景，采集不同种类的桔子精油J1～J10 的近红外光谱图。每种桔子精油取5 个样品，每个样品测3 张谱图，每种桔子精油测15 张谱图。选用RESULT-Integration 软件、RESULTOperation 软件采集桔子精油的近红外谱图保存备用。

2.3 桔子精油中柠檬烯含量的近红外定量分析模型的建立

在10 种不同的桔子精油样品的近红外光谱图中，各取9 张谱图，共90 张谱图为建模校正集样品谱图；各选取1 张谱图，共10 张为验证集样品谱图，进行内部检验。将上述100 张谱图导入TQ Analyst 9.0 软件，选用偏最小二乘法（partial least square，PLS）建立定量分析模型。光程差设为常数；寻找最佳的建模光谱范围及最佳的光谱预处理方式；剔除可疑样品；优化该定量模型。用其校正相关系数RC、校正均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）；预测相关系数 RP、预测均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）；交互验证相关系数RV、交互验证均方差（root mean square error of cross validation，RMSECV） 来评估定量模型的优劣。

2.4 模型的应用

用2.3 所建模型，检测10 种桔子精油样品的柠檬烯含量。将每种桔子精油余下未参与建模的5 张近红外谱图，共50 张谱图作为待测集样品谱图，导入模型进行检测。用各种精油样品的柠檬烯实际含量（GC-MS测定）与模型预测值之间的相对误差，对定量分析模型的准确性进行评估。

3 结果与讨论

3.1 GC-MS测定桔子精油中柠檬烯含量的结果

用2.1 的方法测得J1～J10 桔子精油样品中柠檬烯的含量，分别为 68.5%、71.6%、63.9%、80.2%、72.1%、62.6%、79.8%、71.6%、68.6%、62.1%。

3.2 桔子精油的近红外光谱的对比

将参与建模的J1～J10 的100 张桔子精油样品的近红外光谱图，置于同一窗口，如图2 所示。

由图2 可知，10 种桔子精油的近红外光谱图相似程度很高。因受实验室条件的限制，只有光程差较长的样品管，所测近红外光谱图最大吸收峰的吸光度偏高，建模时所选波段的吸光度值要尽量小于3。

图2 桔子精油样品的近红外光谱图Fig.2 Near-infrared spectrum of orange essential oil samples

3.3 建立测定桔子精油中柠檬烯含量的定量分析模型

将2.3 选定的训练集样品、预测集样品的近红外谱图，导入TQ Analyst 软件，选偏最小二乘法（PLS）进行建模。在预览模型中，剔除8 个异常数据谱图，其中包括7 个为训练集数据谱图，1 个为验证集数据谱图，最终以93 个训练集数据建立了测定桔子精油中柠檬烯含量的定量分析模型；9 个验证集数据为模型内部验证集样品。

经多次筛选得到了建模的最佳光谱范围，即：同时选择 6040.58cm-1～6677.65 cm-1、5 857.66 cm-1～5 657.32 cm-1、4 882.88 cm-1～4 801.88 cm-13 段波谱作为建模光谱范围。在选定的建模光谱范围的基础上，对建模的光谱预处理方式的进行筛选，用其校正相关系数（RC）、校正均方差（RMSEC）、预测相关系数（RP）、预测均方差（RMSEP）、交互验证相关系数（RV）、交互验证均方差（RMSECV）、模型的性能指数来评估定量模型的优劣。具体指标见表2。

比较表2 中数据，某种预处理方式对应的RC、RP、RV3 种相关系数越接近 1，RMSEC、RMSEP、RMSECV3种均方差越小，且数据相近；性能指数越小，则对应所建模型的预测准确性越好，模型的稳定性越好。由表2得出了建模的最佳预处理方式为一阶导数（SG 滤燥）。

表2 不同光谱预处理方式下模型的相关系数及均方差Table 2 The correlation coefficient and mean square error of models under different spectral pretreatment methods

在上述所选的建模的最佳光谱范围及最佳预处理方式下建模，得到了模型近红外光谱（NIR）计算值与标准值之间的相关图，见图3，图4。

图3 NIR 计算值与标准值之间的相关图（含内部验证）Fig.3 Correlation diagram between NIR calculated values and standard values（including internal verification）

图4 NIR 计算值与标准值之间的交互验证相关图Fig.4 Interaction verification correlation diagram between NIR calculated values and standard values

所建模型的 RC为 0.997 7、RMSEC 为 0.412；RP为0.998 2、RMSEP 为 0.396；RV为 0.994 0、RMSECV 为0.662；模型的性能指数为94.7。所建模型误差分布图见图5。

图5 NIR 预测值与标准值之间的误差分布图Fig.5 Error distribution between NIR predicted values and standard values

从图5 可知，所建模型NIR 预测值与标准值之间的误差在-0.8%～1.2%之间。所建模型具有良好的预测能力及稳定性。

3.4 定量分析模型的应用

取J1～J10 桔子精油的50 个待测集样品的近红外光谱图，导入所建模型中，用模型预测其柠檬烯的含量。真实值采用GC-MS 测定J1～J10 桔子精油柠檬烯含量的平均值。通过验证集样品真实值与预测值的误差来验证定量分析模型的准确性。试验结果见表3。

表3 样品中柠檬烯的真实值与验证集样品的预测值Table 3 The true value of limonene in the sample and the predicted value of the proof set sample

续表3 样品中柠檬烯的真实值与验证集样品的预测值Continue table 3 The true value of limonene in the sample and the predicted value of the proof set sample

结果显示，预测J1～J10 桔子精油的柠檬烯含量的平均误差为0.2%～1.1%，相对误差为0.3%～1.5%，表明模型具有良好的预测效果。

4 结论

采用近红外光谱分析技术获取桔子精油的光谱信息，结合偏最小二乘法（PLS）回归分析提取光谱信息中的差异，通过化学计量学将光谱信息差异与对应的柠檬烯测定值关联，建立桔子精油中柠檬烯含量的近红外定量分析模型。所建模型的校正相关系数RC为0.997 7、校正均方差RMSEC 为0.412；预测相关系数RP为 0.998 2、预测均方差 RMSEP 为 0.396；交互验证相关系数RV为0.994 0、交互验证均方差RMSECV 为0.662；模型的性能指数为94.7。模型NIR 预测值与标准值之间的误差在-0.8%～+1.2%之间。所建模型有良好的预测能力及稳定性。近红外光谱技术结合偏最小二乘法（PLS）可以快速检测桔子精油中柠檬烯的含量，模型准确度高。