菌藻混合体系去除Cr（VI）的条件优化及Cr（VI）还原酶活性的测定

杨胜男 刘娜 宋东辉，2

（1. 天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457；2. 天津市海洋资源与化学重点实验室，天津 300457）

随着工业的快速发展，重金属铬作为电镀、制革、印染和制药等行业的化工原料［1]会因泄漏和不合理排放而进入地下水，最终排入海洋，对环境造成严重污染。自然条件下铬主要有Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）两种存在形式［2]，其中Cr（Ⅵ）毒性约为Cr（Ⅲ）的100倍，具有很强的水溶性和迁移能力，并且致癌致畸变作用为Cr（Ⅲ）的1 000倍［3]，Cr（Ⅵ）污染的治理是我国环境保护领域关注的焦点问题。

目前的研究中，铬污染治理的方法主要有吸附法、化学还原法、离子交换法和混凝法等。这些方法成本较高，容易造成二次污染，去除效果不好。而微生物修复技术因其成本低，效益高，无二次污染等特点，在处理铬污染方面凸显巨大的发展潜力。微藻可以吸附重金属，同时利用环境微生物产生的CO2和等合成自身营养物质生长，同时释放O2；而细菌或真菌可以利用水中O2对有机污染物进行分解、转化，产生CO2和上述营养物质，以维持藻类的生长繁殖［4]。因此，菌藻组合体系治理铬污染，可以利用菌藻两类生物之间的生理功能协同作用，达到更加理想的去除污染物的效果［5]。

本研究从天津某印染废水中筛选出两种Cr（Ⅵ）耐受菌，将菌藻组合后降解Cr（Ⅵ）的效果更好。通过对菌藻混合体系的优化，实现了在更短时间内提高Cr（Ⅵ）去除率的效果，旨为进一步开展菌藻混合体系的应用提供理论依据并奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和微藻来源 实验所用Cr（Ⅵ）去除菌分离自天津某印染厂印染废水。羊角月牙藻（SelenastrumcapricornutumFACHB-271）购于中国科学院淡水藻种库（FACHB）。

1.1.2 培养基 （1）LB培养基配方依据参考文献［6]配置。（2）BG-11培养基配方依据参考文献［7]配置。

1.2 方法

1.2.1 Cr（Ⅵ）去除菌的筛选及鉴定 将2 mL印染废水接入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培养基中培养，平板中涂布划线分离3次，28℃培养24 h，得到耐受Cr（Ⅵ）的菌株。将纯化的菌株转接入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培养基中，在同样条件下振荡培养。每隔12 h取样一次，8 000 r/min，离心5 min，测定上清液中Cr（Ⅵ）的浓度，筛选出高效去除Cr（Ⅵ）的细菌，并在-80℃冰箱中保存。

将筛选得到的菌株进行16S rRNA基因扩增分析，PCR引物经华大基因公司测序后，将测序结果递交GenBank数据库获得登录号。再与EzTaxon-e数据库（http ：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）［8]典型菌株的16S rRNA基因进行比对，采用MEGA6.0软件以Neighbor-Joining法构建系统发育进化树。

1.2.2 菌藻混合去除Cr（Ⅵ）研究 将筛选出的两株Cr（Ⅵ）高效去除菌以1∶1的比例加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培养基中，细菌接入总量为5%，与单独细菌去除Cr（Ⅵ）效果进行比较。将混合菌分别以总接菌量为1%、3%、5%、7%及9%加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培养基中，对去除Cr（Ⅵ）效果进行比较。将羊角月牙藻培养至对数期（个数约为5×107个/mL）以不同接藻量与细菌混合加入含有20 mg/L Cr（Ⅵ）的LB培养基中，分别以细菌和单独藻做对照，28℃，150 r/min振荡培养。采用二苯碳酰二肼分光光度法［9]对铬离子浓度进行测定，铬的去除率参考文献［10]中公式计算。微藻的叶绿素a的测定根据文献［11]中的公式计算。

1.2.3 菌藻混合去除Cr（Ⅵ）的条件优化 采用三步法进行菌藻混合体系对Cr（Ⅵ）去除的优化研究。首先根据前期单因素实验结果，利用Placket-Burman设计［12]，以Cr（Ⅵ）去除率为响应值，选出对菌藻体系去除Cr（Ⅵ）影响较大的3个因素。然后利用最陡爬坡设计得到最佳区域，最后利用Box-Behnken设计进行响应面法优化和验证［13]。通过实验数据得到拟合响应面模型的最优条件，并对最优条件进行实验验证。数据处理采用Minitab17软件进行分析。

1.2.4 粗酶液的制备及酶活性的测定 分别将两株除铬菌接入LB培养基中培养过夜，参考文献［14]制

2 结果

2.1 菌种的分离及鉴定

图1 两株细菌16S rRNA的PCR扩增电泳图

图2 系统发育树

2.2 菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）的效果

所以最终选取羊角月牙藻10%接藻量与混合菌混合进行后续优化去除实验。

图3 菌藻混合体系对Cr（Ⅵ）的去除情况

2.3 菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）条件的优化

2.3.1 菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）的单因素试验 分别以pH值、温度、接菌量、NaCl浓度、重金属离子和外加碳源作为单因素条件，考察Cr（Ⅵ）的去除效果。结果发现，菌藻混合体系在pH6.0时对Cr（Ⅵ）去除率最高，24 h达到84.3%，48 h达到95.6%（图4-A）；在温度33℃时对Cr（Ⅵ）去除效果最好，48 h去除率达到95.9%（图4-B）。当接菌量为5%时，对Cr（Ⅵ）去除效果最好，24 h去除65.3%，48 h达到了94.8%（图4-C）。通过加入不同NaCl浓度发现，当NaCl浓度为1%时，对Cr（Ⅵ）去除效果最好，48 h去除率达到96.5%（图4-D）。外加1%（W/V））柠檬酸钠、半乳糖、丙酮酸钠、蔗糖及葡萄糖为碳源，以葡萄糖和丙酮酸钠对Cr（Ⅵ）去除的影响最大（图4-E）。分别选择Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+和Mn2+作为金属离子以10 mg/L的浓度加入培养基中，其中只有Cu2+对Cr（Ⅵ）的去除起促进作用，另外4种离子均起抑制作用（图4-F）。

2.3.2 Placket-Burman实验的优化结果 Placket-Burman实验设计表及实验结果如表1所示，Minitab17软件分析结果如表2所示。由分析可知，实验得到的参照项P值为0，小于显著性水平0.05，说明得到的回归方程显著，即该模型在整个回归区域拟合性较好。温度、Cu2+和葡萄糖3个因素对Cr（Ⅵ）去除率影响显著。这3个因素进一步优化表明，温度对Cr（Ⅵ）去除率有显著负效应，Cu2+和葡萄糖对Cr（Ⅵ）去除率有显著正效应（表3）。剩下的影响因素中，pH值的P值为0.036，小于0.05，Cr（Ⅵ）去除率也有显著性。其他因素的P值均大于0.05，对Cr（Ⅵ）去除率没有显著影响。

图4 pH值（A）、温度（B）、接菌量（C）、NaCl浓度（D）、外加碳源（E）、重金属离子（F）对菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）的影响

表1 Placket-Burman设计各因素与水平

2.3.3 最陡爬坡实验结果分析 从表4中可以看出，第3组即温度30℃，Cu2+30 mg/L，葡萄糖质量浓度2%时Cr（Ⅵ）去除率最高，以此条件为中心点进行后续Box-Behnken响应面分析。

表2 Placket-Burman实验设计及结果

2.3.4 Box-Behnken响应面实验结果 以Cr（Ⅵ）去除率为响应值，以温度、Cu2+浓度和葡萄糖含量设计三因素三水平响应面分析，结果见表5。利用Minitab17对15组试验的响应值进行分析，得到二次多项式方程为：3.061X2X3。根据模型构建的方程做偏微分处理，求出模型中X1=-0.126 7，X2=-0.469 2，X3=0.204 1。可得到去除Cr（Ⅵ）的最优理论条件为：温度29.74℃，Cu2+浓度27.65 mg/L，葡萄糖含量2.41%（W/V）时，由回归方程得出的最优Cr（Ⅵ）去除率为97.01%。

表3 Placket-Burman设计分析结果

表4 最陡爬坡试验设计结果

表5 Box-Behnken设计及实验结果

从表6中可看出，模型方程P值为0，证明该模型是显著的，在回归方程中对Y值影响是极显 著 的，和X2X3对Y值影响是显著的，其他几项对Y值均不显著。

由表7可知该模型显著系数P值为0.003，＜0.01， 失 拟 项 系 数P值 为 0.302，＞0.05， 说 明该回归模型拟合度好，无需再调整。其回归系数R2=0.969 3，调整后为0.914 0，这两个值都高于0.900，且较为接近，所以可以用该模型分析响应值。

表6 回归实验显著性分析结果

表7 回归方程方差分析

用Minitab17分析表5的试验结果，得到响应曲面图和等高线图（图5-图7）。葡萄糖含量和Cu2+浓度，葡萄糖含量和温度这两组的交互作用对Cr（Ⅵ）去除影响较显著（图6和图7）。最终，响应面法优化后的菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）的最佳反应条件为：29.74℃，Cu2+浓度为27.65 mg/L，葡萄糖含量为2.41%（W/V），丙酮酸钠含量2%（W/V），接菌量7%，pH7.0，NaCl浓度为0时，24 h内菌藻混合体系对Cr（Ⅵ）去除率达到97.89%。

2.3.5 验证试验 为了验证拟合的回归模型预测的准确性和有效性，按照优化后的条件进行Cr（Ⅵ）的去除实验。结果表明，菌藻混合体系在24 h时对Cr（Ⅵ）的去除率达到了97.89%，实验值与预测值之间具有良好的拟合性，表明回归方程可以比较真实的预测各个因素对菌藻体系去除Cr（Ⅵ）的影响。与优化前的相比菌藻混合体系24 h内对Cr（Ⅵ）去除率提高30%左右，优化后去除效果明显。

2.4 两株细菌Cr（Ⅵ）还原酶活性测定

2.4.1 不同温度和pH值对Cr（Ⅵ）还原酶的影响 从图8-A中可以看出，两株细菌Cr（Ⅵ）还原酶在20-50℃范围内的相对酶活都可达到80%以上，其中30℃时酶的相对活性最高。这与菌藻混合体系对Cr（Ⅵ）去除效果最好时的温度33℃基本一致。

不同pH值条件下两株细菌胞内Cr（Ⅵ）还原酶的相对活性结果如图8-B所示。菌株S-3的Cr（Ⅵ）还原酶的最适范围偏酸性，而D-7的Cr（Ⅵ）还原酶最适范围偏碱性。如pH为8.0时，D-7 Cr（Ⅵ）还原酶相对活性达到了92.59%，而S-3只有77.43%。菌株S-3的Cr（Ⅵ）还原酶最适pH值为6.0，菌株D-7的Cr（Ⅵ）还原酶最适pH值为7.0。

图5 温度和Cu2+浓度对Cr（Ⅵ）去除率的曲面图（A）和等高线图（B）

图6 葡萄糖和Cu2+浓度对Cr（Ⅵ）去除率的曲面图（A）和等高线图（B）

图7 葡萄糖含量和温度对Cr（Ⅵ）去除率的曲面图（A）和等高线图（B）

2.4.2 Cr（Ⅵ）还原酶动力学曲线 不同Cr（Ⅵ）浓度下，菌株S-3和D-7 Cr（Ⅵ）还原酶动力学曲线如图9所示。结果表明，菌株S-3 Cr（Ⅵ）还原酶 的Km=86.94 μmol/L，Vmax=2.71 μmol/（L·min），菌 株 D-7 Cr（ Ⅵ ） 还 原 酶 的Km=103.18 μmol/L，Vmax=3.38 μmol/（L·min）。

图8 不同温度（A）和pH值（B）条件下Cr（Ⅵ）还原酶的相对活性

图9 菌株S-3（A）和D-7（B）Cr（Ⅵ）还原酶动力学曲线

3 讨论

微生物修复技术在处理水体铬污染方面具有突出的优势，越来越多的Cr（Ⅵ）还原菌被发现，如大肠杆菌（Escherichia coli）［15]、假单胞菌属（Pseudomonassp.）［16]等。本实验从印染废水中筛选到两株能够去除Cr（Ⅵ）的细菌S-3和D-7，分别属于沙雷氏菌属（Serratia）和代尔夫特菌属（Delftia）。二者混合后对Cr（Ⅵ）的去除效果比单一菌株的效果要好，说明两种细菌对Cr（Ⅵ）的去除存在互相促进作用。菌藻之间的相互作用主要有信号传导、营养交换和基因转移3种方式，其中营养交换最为主要。藻类在自身代谢的过程中会分泌出许多可溶性有机物，如维生素、碳水化合物、肽，以及生长因子和促进因子等，分泌出的有机物中有些会被细菌利用用于自身生长［17]。目前已经有很多菌藻共生的研究，可用于修复各种废水。如刘玉沛［5]报道的小球藻与赤红球菌固定后对苯酚的降解率比单独赤红球菌对苯酚的降解率提高了将近1倍。Safonova等［18]从石油污染的废水中筛选得到的红球菌，与小球藻作用能够将0.04 mg/L的Cu2+去除达到62%以上。将混合菌与羊角月牙藻以不同比例混合发现，当微藻接藻量为10%时去除效果最好，而接藻量达20%以上反而对Cr（Ⅵ）的去除起到了抑制作用。这可能是因为藻类自身的代谢过程会产生类黄酮类和缩酚酸等物质［19]，当受到氧化胁迫时产生的防御性物质［20]会对细菌起到一定的抑制作用［21]，进而对细菌去除Cr（Ⅵ）会有一定的影响。同时微藻的光合产氧降低了对氧气供应的需求［22]。同时细菌通过提供CO2和其他刺激生长方式来促进微藻的光合自养［23]，废水中的有害物质会有效地去除。另一方面，细菌在生长过程中也会产生对微藻生长有影响的物质，如Morel等［24]报道的Delftiasp.JD2在含有Cr（Ⅵ）的环境中培养可以生成IAA，可对微藻的生长起到促进作用。所以推测培养基的营养成分和培养条件虽然不适合羊角月牙藻的生长，但是细菌在生长过程中分泌出的物质会为微藻提供营养，所以会使培养基中微藻叶绿素含量有适当的升高。

环境因素对菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）有一定影响。pH值影响微生物代谢过程中酶的活性进而影响自身的生长和污染物的去除［25]。本研究中的菌藻混合体系在较大的pH范围内能正常生长，推测该菌藻体系中的两种细菌各自最适pH值叠加有较宽的适应范围。温度是影响微生物生长繁殖的重要因素，最佳适应温度30-35℃与已报道的Cr（Ⅵ）还原菌大多数细菌的最佳温度相似［26]。碳源可为Cr（Ⅵ）提供电子供体，促进微生物对Cr（Ⅵ）的还原。本研究在添加葡萄糖和丙酮酸钠后促进了Cr（Ⅵ）的还原，与潘翠等［27]研究发现葡萄糖可明显促进芽孢杆菌菌株（Bacillussp.）对Cr（Ⅵ）的还原基本一致。细菌接菌量对Cr（Ⅵ）的去除有较为明显的影响。因为细菌细胞密度与Cr（Ⅵ）的去除能力存在一定的关系［28]。Mabroukik等［29]报道的Streptomycessp.MS-2接种量在5%-15%范围内时，对Cr（Ⅵ）的还原率呈现增长趋势。本研究中Cu2+对培养基中细菌生长有一定的影响，同时可对细菌中Cr（Ⅵ）还原酶起促进作用。已经报道的许多抗Cr（Ⅵ）细菌都具有较强的耐盐性［30]。本研究的两种细菌对NaCl都有很好的耐受性，且在0-4%范围内，菌藻混合体系对Cr（Ⅵ）的去除率都达到了90%以上。

响应面法在微生物降解去除污染物方面被广泛使用。张海涛等［31]利用响应面法优化菌株zhtI（Acinetobacter guillouiae）降解苯酚，降解率达到93.23%。贺强礼等［32]对菌株YH1（Pseudomonas corrugate）降解叔丁基邻苯二酚进行响应面优化，降解率可达98.21%。本研究通过响应面法优化菌藻混合体系后，在提高Cr（Ⅵ）去除率的同时，缩短了处理时间。这在快速处理含铬废水，控制有效成本方面具有很好的借鉴意义。

温度和pH值会影响酶的相对活性。如魏斐等［33]筛选出C-2苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensisC-2）中的还原酶最适pH值为7.0，并且在25-37℃范围内保持良好活性。Pal等［34]从土壤中筛选出的Bacillus sphaericusAND303中Cr（Ⅵ）还原酶的Km为 158.12 μmol/L，Vmax为 1 432 nmol/（L·min）。本研究中的S-3和D-7来自印染废水，其Cr（Ⅵ）还原酶的酶促反应动力学常数与其他Cr（Ⅵ）还原菌存在一定差异，表明不同细菌Cr（Ⅵ）还原酶活性因其适应的生长环境不同而有一定差别。

4 结论

从印染废水中筛选到两株除Cr（Ⅵ）菌，经16S rRNA鉴定分别属于沙雷氏菌属和代尔夫特菌属，并且在等比例混合后去除Cr（Ⅵ）效果优于单独菌株的去除效果。菌藻混合体系中，羊角月牙藻以10%的接藻量去除Cr（Ⅵ）的效果最好。通过Placket-Burman实验设计、Box-Behnken实验设计及响应面法分析，确定菌藻混合体系去除Cr（Ⅵ）的最优条件为：温度29.74℃，Cu2+27.65 mg/L，葡萄糖2.41%（W/V），丙酮酸钠2%（W/V），接菌量7%，pH7.0，NaCl浓度为0时，24 h内菌藻混合体系对Cr（Ⅵ）去除率达到97.89%。菌株S-3和D-7的Cr（Ⅵ）还原酶最适pH值分别为6.0和7.0。菌株S-3 Cr（Ⅵ）还原酶的Km为 86.94 μmol/L，Vmax为 2.71 μmol/（L·min），菌株D-7 Cr（Ⅵ）还原酶的Km为103.18 μmol/L，Vmax为 3.38 μmol/（L·min）。