数字PCR和荧光定量PCR诊断急性期布鲁菌病的灵敏度比较初步研究

韩 冰，吴翠萍，赵 芯，刘贵明，蒋荣猛

布鲁菌病是由布鲁菌感染导致人畜共患疾病，主要以发热、大汗、关节痛、肝脾大和慢性化为特征，在全球均有流行，我国主要集中于新疆、内蒙古、黑龙江、甘肃、宁夏等牧区，但随着畜牧业和交通运输业的发展，病例逐渐向城市扩散，北京地区病例逐年增加。布鲁菌病诊断主要依靠分离培养、抗体检测和核酸检测。布鲁菌血培养阳性率低，且存在安全性问题，临床应用受限。抗体检测技术在临床应用最广，但是缺乏大样本临床研究，导致具有诊断意义的抗体滴度存在争论，比如，关于布鲁菌病急性期试管凝集试验诊断标准，我国与WHO推荐的不一致，我国推荐试管凝集试验（standard tube agglutination test, SAT）滴度≥1∶100，WHO推荐SAT滴度≥1∶160。荧光定量PCR检测技术在国外证实灵敏度和特异度较高，被美国CDC推荐用于布鲁菌病诊断。但是，荧光定量PCR技术在我国应用可能存在两方面问题，一是我国布鲁菌病患者从发病到诊断时间较长，部分患者诊断前应用抗生素进行治疗，国内常用的头孢类和喹诺酮类抗生素治疗布鲁菌病有效，导致菌血症存在时间短，布鲁菌核酸血清含量低，荧光定量PCR临床研究结果可能和国外研究存在差异。二是荧光定量PCR受到PCR抑制物、标准品质量和标准曲线偏倚的影响，导致室间质量评价依从性差，不同实验室间检测结果可比性差。数字PCR技术为绝对定量技术，检测灵敏度优于荧光定量PCR技术，在各实验室之间具有高度可重复性，在国外已被作为HIV和HBV病毒载量临床检测技术。本研究拟建立用于布鲁菌检测的数字PCR技术，先期选取20例符合急性期布鲁菌病诊断标准的患者血清样本进行小样本研究，初步比较数字PCR与荧光定量PCR检测布鲁菌的灵敏度差异，并分析原因，为后续开展大样本实验室诊断技术提供参考，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 血清标本来源于2018年4—8月就诊于潍坊益都中心医院的急性期布鲁菌病患者，阳性对照菌为中国CDC布鲁菌病实验室捐赠。急性期定义为符合布鲁菌病诊断标准，病程6个月以内[1]。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 Qubit dsDNA assay kit （Q32853，Invitrogen）、ddPCR Supermix for Probes （no dUTP）（186-3024，Bio-Rad）、ddPCR Droplet Reader Oil （186-3004，Bio-Rad）、Droplet Generation Oil for Probes （1863005，Bio-Rad）、Taqman Fast Advanced Master Mix（4444963，Applied Biosystems）、5 min TA/Blunt-Zero Cloning kit （C601-01，Vazyme）、DH5α Competent cell（CW0808S，康为世纪）、QIAprep mini kit （27104，QIAGEN）

1.2.2 主要仪器 桌面小型离心机（CUBEE，台湾CUBEE）、涡旋振荡器（Vortex 5，其林贝尔）、Qubit 3.0 荧光定量仪（Qubit3.0，Invitrogen）、微量移液枪（Eppendorf）、QX200™Droplet Digital™PCR System （QX200，Bio-Rad）、Bio-Rad T100 PCR仪（T100，Bio-Rad）、PX1封膜仪（PX1，Biorad）、-20℃冰箱 （BD-226W，青岛海尔）、Bio-Rad 荧光定量PCR仪（CFX 96，Bio-Rad）。

1.3 探针序列

1.3.1 数字微滴PCR实验所用探针序列由江苏泓讯生物科技股份有限公司合成。IS711正反向引物及探针序列：IS711-F ATGTTTTCTCGCATCGCAGC；IS711-R AGGAACGCCATCAGATTGAA；IS711-Probe FAM-CGACGATAGCGTTTCAANFQ-MGB。RB51正反向引物及探针序列：RB51-F CCGGGCGTACCAACTCG；RB51-R CGAAGCCTTACAGATGAGCAA；RB51-Probe FAMAAGATATGCTTCGATCCGGT-NFQ-MGB。

1.3.2 荧光定量PCR实验所用探针序列由江苏泓讯生物科技股份有限公司合成。IS711正反向引物及探针序列：IS711-qF GACTGGAGGCTGTACAAGGA；IS711-qR ATGGACGAAACCCACGAATG；IS711-qProbe FAM-TCGCATCGCAGCGCAATGCGBHQ； RB51正反向引物及探针序列：RB51-qF TGGCGTCGACAAATAATCGG；RB51-qR TGGAACCGGATCGAAGCATA；RB51-qProbe FAM-CTGCGGCCGGGCGTACCAAC-BHQ。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 取1.0 ml 菌悬液于1.5 ml 的离心管中，10 000 r/min 离心5 min，弃去上清。按照DNA 提取试剂盒说明书进行DNA 提取操作，将提取的DNA 放置-20 ℃保存备用，并将DNA溶液用Gene Quant 定量仪测浓度和纯度。

1.4.2 数字微滴PCR检测

1.4.2.1 用阳性对照M3（中国CDC提供羊布鲁菌DNA）做浓度梯度检测所设计探针的有效性及灵敏度 对阳性对照样本M3进行梯度稀释，按照10倍梯度稀释法得到以下梯度样本：1 ng/μl，1×10-1ng/μl，1×10-2ng/μl，1×10-3ng/μl，1×10-4ng/μl，1×10-5ng/μl。配置体系，体系中模板投入量为1μl，10 μM 正向引物和反向引物各 1.8 μl使整个体系中引物终浓度为900 nM，1 μM探针加入5 μl使终浓度为250 nM，加入ddPCR Supermix 10 μl， 补水至体系总反应体系 20 μl。

体系配好以后指弹法混匀，桌面离心机快速离心使液体收集到管底。将20 μl反应体系和70 μl微滴生成油小心分别转入加样孔和加油孔中，盖上胶垫，转入微滴生成仪。反应结束后，将微滴生成的产物约40 μl体系转入96孔板中。将96孔板盖上专用的可穿透膜，用预热到180 ℃的PX1封膜仪对其进行封膜（180 ℃，10 s）。封膜后将96孔板放入T100中进行PCR反应。反应条件为95 ℃ 10 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 60 s， 40 个循环；98 ℃ 10 min。

将反应结束后的96孔板放入QX200中的96孔板固定装置组装好。打开电脑中的QuantaSoft软件，在读取实验结果前先做一遍Flush Syster。之后在软件中对96孔板样本信息进行程序设置，实验类型选择绝对定量。

检查程序设置信息无误后即可运行程序，结束后检查实验数据。观察微滴生成数是否符合泊松分布，人工核实调整出现阈值判读失误的数据，保存实验结果并进行后续的解读分析。

1.4.2.2 用M3测试有效的探针检测20例临床患者DNA标本 实验中使用布鲁菌DNA（M3：1×10-4ng/μl）作为阳性对照，用2例健康人血清提取DNA作为阴性对照。测试样本为20例急性期布鲁菌病患者的血清DNA。整个体系中引物终浓度为900 nM，探针终浓度为250 nM。阳性对照模板加入量1×10-4ng，待测样本和阴性对照由于都是人血清DNA，投入20 ng作为模板配制20 μl PCR反应体系。

体系配好以后指弹法混匀，桌面离心机快速离心使液体收集到管底。如前文所述将样本转移至微滴生成卡槽中在微滴生成仪上进行微滴生成后将反应产物40 μl转移至96孔板中封膜后进行PCR反应。将反应结束后的96孔板放入QX200中的96孔板固定装置中组装好。打开电脑上的QuantaSoft软件，在读取实验结果前先做一遍Flush Syster。之后在软件中对96孔板样本信息进行程序设置，实验类型选择绝对定量。

检查程序设置信息无误后即可运行程序，结束后检查实验数据，人工核实调整出现阈值判读失误的数据，保存实验结果并进行后续的解读分析。

1.4.3 荧光定量PCR检测

1.4.3.1 标准品制备和标准曲线测定 以羊标准菌株M3 DNA为模板，分别用前文所述引物（IS711-qF/IS711-qR，RB51-qF/RB51-qR）扩增目的片段为120 bp和85 bp，使用QIAquick gel extraction kit （QIAGEN，28704）对目的条带进行切胶回收。使用克隆试剂盒（C601-01，vazyme）将目的条带克隆至载体（pCE2 TA/Blunt-zero 质粒）后热击法转化至DH5α感受态中，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上37 ℃过夜培养。挑取单克隆进行Sanger法测序确认插入序列正确后扩大培养，使用QIAprep mini kit（27104，QIAGEN）进行质粒提取并用Qubit检测质粒浓度。将所制备的质粒浓度换算成拷贝数，其中每微开样品中检测基因拷贝数按以下公式估算：样品拷贝数=浓度（ng/μl）×阿伏伽德罗常数×10-9/（660×重组质粒碱基数），阿伏伽德罗常数=6.02×1023mol-1。将质粒按基因拷贝数 10 倍梯度稀释为 2×101～ 2×106copies/μl。

1.4.3.2 荧光定量PCR检测20例临床患者DNA标本 用Taqman qPCR试剂配制20 μl体系，体系中使用引物和探针的终浓度均为200 nM，标准品投入量按质粒拷贝数梯度各加入1 μl。M3作为阳性对照，2例健康人血清DNA作为阴性对照，20例临床患者血清DNA样本作为研究对象，各投入2 μl作为模板。反应程序为50 ℃ 2min，95 ℃2 min，95 ℃ 30 s /60 ℃30 s 40个循环。运行结束后分析实验数据。

2 结 果

2.1 数字PCR检测结果 具体见表1和表2。3、6和11号标本为血培养阳性标本，数字PCR检测为阳性结果，IS711引物检测结果3者分别为23.15、15.57、10.17 copies/μl，RB51 引 物 检 测结果分别为 22.80、12.17 和 10.03 copies/μl。其余17个血培养阴性但临床诊断急性期布鲁菌病患者血清DNA检测为阳性，检测拷贝数较低，IS771引物检测拷贝数集中于0.10～38.57 copies/μl，RB51引物检测拷贝数集中于0.08～40.97 copies/μl。

表1 数字PCR IS711检测结果Table 1 Digital PCR IS711 test results

表2 数字PCR RB51检测结果Table 2 Digital PCR RB51 test results

2.2 荧光定量PCR检测结果 荧光定量PCR检测结果显示，M3阳性样本3个重复平均CT值为14.28，而20例急性期布鲁菌病患者血清DNA和2例健康人全血DNA CT值均≥36，与无模板对照（CT=37）持平，基本不具有参考讨论意义，判定为无阳性检出。

2.3 患者临床信息 共入组20例患者，其中男16例，女4例，血培养阳性3例，血培养阴性但符合急性期布鲁菌病血清学诊断标准患者17例。20例患者发病到诊断时间为4～120 d，平均为36.9 d。患者均有羊、牛接触史，有9例伴有脊柱炎或骶髂关节炎或椎旁脓肿。入组前有13例抗生素治疗史（8～26 d），19例患者有不同程度的发热。

3 讨 论

目前，我国用于布鲁菌病诊断主要有3种方法：一是血清学检测方法，有虎红平板凝集试验（rose-bengal plate agglutination test, RBPT）、SAT、ELISA、补体结合试验和Coombs试验，但诊断灵敏度和特异度存在争议[2-5]。二是细菌分离培养，是诊断的金标准，但存在培养时间长，阳性率低，且存在生物安全性风险[6]。三是分子生物学诊断技术，PCR具有高效、省时、安全等特点，已被用于布鲁菌检测[7]。

目前，国内和国外对血清学诊断技术诊断效能存在争议。Peeridogaheh等[8]领导的研究团队系统评价了各项实验室诊断技术对于急性期布鲁菌病诊断的参考价值：RBPT试验灵敏度为48.1%，ELISA 法检测IgG、IgM灵敏度分别为65.6%和49.6%，IgG+IgM灵敏度为34.35%，Coombs试验灵敏度为72.5%。RBPT试验特异度为96.1%，其余各项试验技术特异度接近100%。其他两项研究也证实参考目前布鲁菌病诊断标准，存在误诊、漏诊情况[9-10]。我国主要采用RBPT和SAT技术进行布鲁菌病诊断。文献报道RBPT和SAT在急性期布鲁菌病中诊断与临床符合率较高，与国外文献报道差异较大[11-12]。分析原因可能为：①我国指南现行诊断标准推荐RBPT作为初筛试验，SAT作为确证试验，WHO则推荐RBPT、SAT作为初筛试验，Coombs和ELISA作为确证试验。RBPT和SAT同为抗体凝集试验，同时作为初筛和确证试验，诊断效能上存在一定交叉。②我国指南规定SAT诊断滴度≥1∶100，WHO指南则推荐SAT诊断滴度≥1∶160，2者差异明显，直接导致SAT诊断的灵敏度差异。

荧光定量PCR能够快速检测布鲁菌，能在种水平上鉴定牛、羊、猪和犬种,且不须进行电泳分析，可避免污染，已被用于布鲁菌诊断，IS711和RB51为最优效的靶基因序列[13]。但是，荧光定量PCR为相对定量技术，其精确性和稳定性，受到PCR抑制物、标准品质量和标准曲线偏斜的影响，导致各实验室之间的可比性差，作为临床常规检测技术存在不足[14]。而且，荧光定量PCR在我国用于布鲁菌病临床检测技术可能存在问题，我国布鲁菌病患者诊断周期长，患者多自行服用抗生素治疗，常用的头孢类和喹诺酮类抗生素治疗布鲁菌病有效，导致布鲁菌血清含量低，存在时间短。针对我国国情而言，需要更为敏感和稳定的PCR检测技术。

数字PCR对样品中的核酸进行定量分析，不依赖标准品，也不需要标准曲线，可直接对核酸靶标进行绝对定量。具有比荧光定量PCR更高的重现性和更小的变异性。在国外已被应用于HIV和HBV病毒载量测定[15]。同时，数字PCR技术检测下限为0.001%，灵敏度较荧光定量PCR高1000倍，有作为布鲁菌病标准实验室检测方法的潜力。

本研究结果显示，符合急性期布鲁菌病诊断标准的20例血清标本，数字PCR检测结果均为阳性，荧光定量PCR检测均为阴性，出现极端的结果。为避免实验技术造成误差（常见的如引物问题），本试验分别选取IS711和RB51为靶基因序列进行检测，结果显示，2者均为数字PCR检测全阳性，荧光定量PCR检测全阴性。同时，数字PCR检测结果显示，分别以IS711和RB51为靶基因序列进行检测，血清布鲁菌含量较为一致。上述结果证实，实验操作过程不存在问题。

本研究结果显示，数字PCR检测均为阳性，拷贝数集中在0.08～40.97 copies/μl，总体标本拷贝数水平低，而荧光定量PCR检测均为阴性。分析原因可能为：①荧光定量PCR通过在反应体系中加入荧光试剂或者荧光标记的探针来实时检测荧光信号，借助荧光曲线的CT值来定量起始靶基因的浓度。 在低拷贝靶分子、模板背景复杂等情况下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。②数字PCR可以将一个完整的PCR体系通过微滴生成反应分散为成千上万个独立的反应，每个反应中都包含1个或者0个模板。这些反应互不干扰，反应结束后，通过检测独立微滴的反应产物进行计数来确定阳性拷贝数。这种检测方式不依赖于标准曲线，也可以排除样本背景干扰。③实验中使用的阳性对照为纯培养的布鲁菌提取DNA，样本单一，所以在数字PCR和荧光定量PCR中都可以检出。但临床患者血清提取DNA为患者核酸和低拷贝的布鲁菌核酸混合物，在荧光定量PCR中由于反应在同一个体系中进行，大量的人基因组会干扰引物和探针的特异度反应，而数字PCR不存在这样的问题。

本研究根据布鲁菌保守基因设计引物，合成探针，建立了用于布鲁菌的数字PCR检测技术，初步证实数字PCR技术可以作为急性期布鲁菌病实验室诊断技术的有效补充。但本研究具有局限性，主要集中在以下两方面，一是急性期布鲁菌病患者标本少，影响实验结果的可信度；二是2种实验室检测技术比较需要在多个实验室进行验证，证实2者之间的优劣，避免实验误差带来的影响。后期研究中将扩大样本量，纳入阴性对照病例，设立完整诊断试验方案，进而研究2种PCR技术的灵敏度和特异度。