基于性状鉴别和DNA条形码联用的虎尾海马生药学研究△

来梦茹，方昀，葛宇清，黄真，张光霁，程汝滨*

1.浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学 第一临床医学院，浙江 杭州 310053

海马在中国素有“南方人参”之称，早在《神农本草经》中就有记载，传统中医药学认为其既善补肾壮阳益精，治肾阳虚衰之证，又能活血散结、消肿止痛、治徵瘕积聚和疮肿等症[1]。2015年版《中华人民共和国药典》收载了5种药用海马，分别为小海马Hippocampusmohnikei、大海马H.kuda、刺海马H.histrix、线纹海马H.kelloggi、三斑海马H.trimaculatus的干燥体，但对其性状描述较为简略[2]。在中医药大健康产业发展背景下，对海马等传统的名贵滋补类中药的需求量日益增加。但天然海马的产量本身不高，加之气候和环境变化，导致我国海马药材的生产量远不能满足需求量，其中70%以上的海马药材资源需要依靠进口。由于海马动物种类繁多，亲缘关系和品种性状相近，不易区分，导致近年来市场上的海马品种较为混乱，掺伪掺假现象越来越频繁，严重影响了海马药材临床用药安全[3-5]。

虎尾海马H.comes作为流通在中药市场上的药用海马伪品之一，主要分布于菲律宾、印度尼西亚、马来西亚、泰国、新加坡等东南亚地区的近岸海域[6-7]。因过度捕捞和环境破坏，其在部分地区数量已经减少了70%[8-9]。在药材市场中，虎尾海马常被作为刺海马的伪品之一流通使用，关于虎尾海马的研究处于起步阶段，相关的文献资料较少。不同海马干燥体的外观差异不明显，鉴别难度较大，且海马药材常以药材粉末形式流通，为海马品种的鉴别带来了极大的困难，故亟需建立有效的鉴定方法来改善市售海马的流通现状，提高海马药材的质量。

目前对虎尾海马的生药学鉴定研究尚未见相关报道，本文拟利用性状鉴别联合DNA条形码鉴定技术对虎尾海马进行系统的生药学研究，提供虎尾海马典型的性状和分子鉴别特征，为虎尾海马的快速准确鉴定提供技术保证，为后续的药用海马销售市场规范和法规制定提供参考，为海马药材用药安全管理奠定基础。

1 材料

1.1 药材

本实验共收集海马药材样品28份，分别购自安徽亳州、浙江磐安、山东威海的药材市场和海马养殖厂，包括虎尾海马样品20份，三斑海马样品4份，直立海马样品4份。经浙江中医药大学第一临床医学院葛宇清副研究员鉴定，分别为虎尾海马、三斑海马和直立海马。将所用样品做好标记，于干燥封口袋中避光保存，样品保存于浙江中医药大学药学院。同时在GenBank数据库中下载26条COI序列(线纹海马H.kelloggi4条，大海马H.kuda4条，刺海马H.histrix4条，棘海马H.spinosissimus4条，太平洋海马H.ingens4条，小海马H.mohnikei4条，拟海龙Syngnathoidesbiaculeatus和刁海龙Solegnathushardwickii各1条)。为保证下载序列与物种对应关系的正确性，本文对GenBank数据库获取的26条COI序列一一进行了NCBI-BLAST同源性比对分析，结果表明引用序列与其他同种海马的COI序列同源性达98%以上，确保了引用序列的准确性。样本来源及其DNA条形码序列详细信息见表1。

表1 海马样品来源及COI序列信息

1.2 试剂

无水乙醇(西陇化工有限公司)；海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；琼脂糖粉(Solarbio)；50×TAE缓冲液[生工生物工程(上海)股份有限公司]；DL2000 DNA Marker(TaRaKa公司)；6×Loading Buffer(TaRaKa公司)；溴化乙锭染料(Solarbio)；10×PCR buffer(TaRaKa公司)；dNTP Mix(TaRaKa公司)；r-Taq酶(TaRaKa公司)；引物COI由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 主要仪器设备

多功能精密电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；恒温金属浴锅(上海培清实验仪器有限公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一有限公司)；超微量分光光度计(美国Amersham公司)；微波炉(青岛海尔有限公司)；PCR仪、离心机[宝生物工程(大连)有限公司]。

2 方法

2.1 DNA提取

将20个虎尾海马样品进行编号，用75%乙醇擦拭尾部，分别剪取约5 mg的尾部组织于EP管中，样本的基因组总DNA均用DNA提取试剂盒(Takara公司)提取，按照试剂盒说明书进行提取。用超微量分光光度计检测样本DNA的纯度和浓度，置于-20 ℃保存。

2.2 PCR扩增及测序

在COI序列通用扩增引物LCO1490/HCO2198的基础上[10]，结合海马属已知COI基因的序列特点，优化设计了虎尾海马的COI基因的扩增引物COI-F和COI-R，其中引物的序列信息如下，正向引物COI-F：5′-TTCTCAACTAATCACAAAGACATCGGCA-3′；反向引物COI-R：5′-ACTTCAGGRTGTCCRAAGAATCAG-AATAAG-3′。以样品DNA作为模板，对样品的COI序列进行PCR扩增，查阅文献并结合实际实验情况加以验证，优化确定最佳扩增体系与反应程序进行扩增[11]。采用的50 μL PCR扩增体系：10×PCR buffer 5 μL，r-Taq酶0.5 μL，dNTP Mix 5 μL，上游引物(F)1 μL，下游引物(R)1 μL，模板DNA 5 μL，加ddH2O补足至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，52 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，33个循环；72 ℃延伸15 min，4 ℃保存。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，参照DNA maker电泳条带读出PCR产物的大小和质量(检查条带是否含有杂带以及是否明亮单一)，纯化后寄往上海桑尼生物科技有限公司测序，样品均采用ABI3730 XL测序仪双向测序。

2.3 数据处理与序列分析

通过提取DNA、PCR扩增和产物测序，将测序结果在BLAST中进行比对。去除上下游引物序列，用Clustal W进行序列比对，两两产生同源性，将20条虎尾海马样品的COI序列结果提交至GenBank数据库，登录号详见表1。利用MEGA 7.0软件计算所测COI序列碱基组成和长度，基于K2P双参数模型计算并分析碱基变异位点、信息位点、转换/颠换、种内及种间遗传距离等；通过邻接法构建系统进化树(NJ树)，分析虎尾海马与其他海马之间的亲缘关系。

3 结果

3.1 性状特征鉴别

虎尾海马与线纹海马、大海马、三斑海马和小海马的形态区别明显，但与刺海马较为相似，容易混淆，因此常被作为刺海马伪品在市场上流通。研究观察表明，虎尾海马最大体长18.7 cm，体表多为褐色，体上棘状突起较为明显，呈钮状，尖端大多黑色，体环11个，尾环多为35～36个。头冠矮小，顶端有5个明显的圆形突起，吻长不及头长1/2，鼻刺显著，具双颊棘。体轻，骨质坚硬，气微腥，味微咸。虎尾海马的体表多花斑，尾部有交替出现的斑纹，似老虎的尾巴，虎尾海马因此而得名，这一特点是虎尾海马最典型的鉴别特征，也是与刺海马的重要区别点。虎尾海马干燥体形态如图1所示。

图1 虎尾海马干燥体形态

3.2 条形码序列和遗传距离分析

本研究对20个虎尾海马样品的COI基因进行了PCR扩增及测序，采用MEGA 7.0软件对COI序列的长度、GC含量、碱基变异位点、信息位点、转换/颠换等进行分析。结果表明，虎尾海马的COI序列全长649 bp，其中A、C、G、T碱基平均含量分别为27.13%、22.80%、16.93%、33.14%，G+C平均含量为39.73%，明显低于A+T平均含量60.27%。COI基因序列在虎尾海马不同个体之间存在一定的种内变异率，其中保守位点643 bp，变异位点6 bp，变异率为0.92%。在20个虎尾海马样品中COI序列的信息位点为1 bp，转换值为1，不存在颠倒现象。通过虎尾海马COI序列的单倍型数目分析发现，虎尾海马COI序列存在6种单倍型，其中主导地位的单倍型为A3，占样品总量的70%，提示COI条形码序列在虎尾海马种内存在一定的变异率，可用于后续的种群和地理进化关系研究。

将获得的20个虎尾海马样品COI序列和其他8种正伪品海马样品的COI序列进行分析，基于K2P参数模型计算虎尾海马COI基因的种内和种间遗传距离(见图2)。结果表明，COI条形码序列在虎尾海马的最大种内遗传距离远小于其最小的种间遗传距离，虎尾海马COI序列的种内遗传距离为0.000～0.004 9，种内平均遗传距离为0.001 1，虎尾海马与其他8种海马样品的种间遗传距离为0.085 7～0.158 4，其中与直立海马的种间遗传距离最大(0.158 4)，与刺海马的种间遗传距离最小(0.085 7)，种间的平均遗传距离为0.123 9。虎尾海马COI序列最小种间遗传距离是其最大种内遗传距离的17.5倍，存在显著条形码间隙(barcoding gap)，因此通过分析不同海马样品的COI序列，可将虎尾海马与其他不同海马品种明显区分。

注：**P<0.01。图2 虎尾海马与其他海马COI序列遗传距离分析

3.3 NJ树聚类分析

为进一步确定COI序列在虎尾海马和其他海马正伪样品间的鉴定能力，本文以K2P为参数模型，基于COI序列采用邻接法构建虎尾海马、8种其他正伪品海马和2种海龙的NJ树，并通过bootstrap(1000次重复)检验各分支支持率。图3结果表明，虎尾海马的20个样品聚成一个大分支，其分支支持率为100%，明显与其他8种海马和2种海龙区分开。此外，虎尾海马内部存在一定的分支亚群，但其分支支持率较低，且进化树结构不稳定。虎尾海马与刺海马聚集成一分支，其支持率为95%，说明虎尾海马与刺海马的亲缘关系较近，可作为刺海马的替代品用于后续的研究和开发。通过COI序列的NJ树聚类分析，可将虎尾海马与其他的海马品种明显区分，为虎尾海马的鉴定提供了快速准确的方法。

4 讨论

本文对虎尾海马的性状特征和DNA条形码进行了系统研究，明确了虎尾海马与常见正伪品海马样品间最显著的鉴别特征，对条形码COI序列在虎尾海马种内种间的变异率、遗传距离和NJ树聚类进行了分析，为虎尾海马快速准确鉴定技术的开发奠定了基础。

传统的中药材鉴定方法包括性状鉴别、显微鉴定、粉末鉴定和理化鉴别等。前期文献报道不同海马药材粉末显微鉴定过程中，发现不同海马品种来源的皮肤碎片、横纹肌纤维、骨碎片和胶原纤维等显微结构多样，但种间差异不具有统计学意义，无法准确鉴别海马的种类[12]。因此，本研究采用了性状鉴定和分子鉴定联用技术，对中药市场上常见的海马伪品虎尾海马进行生药学研究。实验结果表明，20条虎尾海马样品中存在6种单倍型，说明COI条形码序列在虎尾海马种内存在一定的变异率，可用于后续的种群和地理进化关系研究。虎尾海马的COI序列总长度649 bp，碱基A+T的含量大于碱基G+C的含量，同时4种碱基中G的含量较其他3种碱基低，这与脊椎动物线粒体DNA特点一致[13]。

图3 基于COI序列构建的虎尾海马系统发育树

DNA条形码(DNA Barcoding)是一种新兴的生物分类学技术，近年来在中药材鉴定及相关领域有迅速的发展和应用。构建中药材DNA条形码分子鉴定数据库，有利于对中药材的准确快速鉴定，为保证临床用药安全提供坚实基础[14-15]。其中，COI基因是动物药DNA条形码序列的首选序列，具有PCR扩增效率高、进化速率快、种间遗传大于种内遗传等特点[16]。张辉等[17]选取了《中华人民共和国药典》中45个动物药材进行研究，结果表明COI序列作为DNA条形码适用于《中华人民共和国药典》中动物药材的鉴定，在药用动物的分类鉴定中可被广泛应用。赵群等[18]研究了6种蟾蜍及4种易混淆品的COI线粒体基因DNA序列，证明COI条形码能够准确鉴定中华蟾蜍。张红印等[19]研究了5个物种50份蜈蚣样品，证实COI条形码序列可以准确鉴定蜈蚣及其混伪品。石林春等[20]研究了13个物种68份蛇蜕原药材样品，说明COI条形码不仅可以鉴定中药材蛇蜕的3种基原，而且可以区分蛇蜕及其易混伪品。张改霞等[21]对21个物种211条海马及其混伪品的COI序列进行分析，证明COI序列能够作为DNA条形码准确鉴定海马及其混伪品。基于上述研究结果的启发与指导，故本文采用COI基因作为鉴别虎尾海马及其他正伪品海马的DNA条形码。研究结果表明，COI序列在虎尾海马的种内种间遗传距离存在显著条形码间隙，NJ树聚类分析表明，虎尾海马单独聚为一支，且节点支持率均达到100%，结果说明了通过COI条形码序列，可准确区分虎尾海马与其他市场常见的正伪品海马，也进一步证实了COI条形码在动物类中药分类鉴定中的通用性和准确性。本文的研究为COI条形码准确鉴定动物药虎尾海马提供了分子依据，扩充了DNA条形码数据库中药用动物序列，并为建立海马分子鉴定技术流程奠定了基础。

COI条形码序列作为一种线粒体基因，被广泛应用于分类鉴定、系统发育关系和种群遗传结构的研究中。海马作为重要的海洋药用动物，其均属于海龙科海马属动物，其亲缘关系较近，利用单一条形码在鉴定过程中有时无法准确区分，影响分子鉴定的准确性。蒋超等[4]研究表明，COI序列进行NJ聚类分析时，管海马、太平洋海马、西非海马、吻海马、短吻海马和南非海马等共同聚为一大支，形成管海马复合体，而无法相互区分。Chang等[22]已经完成了虎尾海马的线粒体全序列测定工作，为其后续的鉴定与进化分析研究奠定了基础。与单个线粒体条形码基因相比，线粒体全序列包含的遗传信息更丰富、变异位点和序列更多样，故可通过不同药材品种间的线粒体全序列比对，确定物种间最显著的差异序列，为后续的DNA条形码开发奠定基础[23-24]。课题组长期致力于中药资源的开发和分子鉴定等方面的工作，近年来在海马等海洋动物类药材的分类鉴定和DNA条形码开发等领域做了部分工作。为建立适用于海马药材分子鉴定的技术体系，课题组通过获得线粒体全基因组序列，建立海马及其混伪品的系统发育关系，明确不同海马来源的分子进化地位，筛选速度适中的可用于区分近缘海马的DNA条形码分子标签。目前，课题组已完成包括线纹海马、棘海马、南非海马、欧洲海马和驼背海马在内的7种海马线粒体基因组全序列，为规范海马中药材市场的技术开发奠定基础，也为我国海马资源的遗传多样性保护、资源开发与利用、海马良种选育提供了数据支撑[25-30]。

虎尾海马作为常见海马药材之一，来源广，数量多，养殖存活率相对于其他海马较高，具有良好的开发应用前景[31]。作为海马属的模式物种之一，虎尾海马的全基因组测序工作已经完成[32]。测序和分析结果表明，相比于其他硬骨鱼基因组，虎尾海马基因组中蛋白质和核甘酸的进化速率最快，其丢失了大量的顺式调控元件，这些缺失可能在海马的演化革新中发挥重要作用。虎尾海马的全基因组信息，有助于揭示了海马特异体形和独特生活方式的形成原因，也为海马资源的药用价值开发和濒危资源保护技术运用提供指导。本文在性状鉴定和分子鉴定实验的基础上，对虎尾海马的性状和DNA条形码鉴定技术进行了系统开发，为虎尾海马后续开发过程中品种的准确鉴定提供了技术保证，也为海马药源的扩展和养殖品种的引进开发提供了科学参考和数据支撑。