反复种植失败诊断标准的研究进展

刘道英，张建伟

反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF）是指不孕症患者经历多个体外受精（in vitro fertilization，IVF） 或 胞 浆 内 单 精 子 注 射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI） 周期并移植了多个胚胎而未发生胚胎着床或临床妊娠。胚胎植入成功的概率只有30%左右[1]。低种植率始终是生殖医学领域尚未解决的问题之一，而且RIF会对患者及家庭造成沉重的经济负担和精神压力。虽然很多研究都围绕这一问题展开，但对RIF的定义仍未达成共识[1]，主要包括移植胚胎周期数、移植胚胎数量及质量、移植胚胎期别与周期类型、年龄等方面的争议，回溯近年有关RIF的研究报道，共检索到文献14篇，考虑到观点相似剔除2篇，共有12种诊断标准，并以Coughlan等[1]提出的“年龄小于40岁，移植3个周期（包括新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植），4个及以上优质胚胎，未获得妊娠的不孕女性”这一定义被采用率最高。现对RIF诊断标准的演变过程及争议问题进行综述。

1 RIF诊断标准的演变过程

世界范围内并无统一的RIF诊断标准，通过查阅文献整理出12种诊断标准（见表1）。由表1可以看出，2005—2018年RIF的诊断标准在移植周期数上趋于减少，并且主要是2个周期和3个周期的争议；累积移植胚胎数量亦趋于减少，几乎均提到了优质胚胎移植，并且越来越重视年龄与胚胎期别在RIF诊断标准中的重要性。

表1 RIF的诊断标准

2005年，Tan等[2]定义RIF为2～6个周期以上，≥10个优质胚胎移植着床失败；同年Thornhill等[3]提出≥3个周期，≥10个优质胚胎移植未获临床妊娠；2006年Margalioth等[4]提出≥3个周期，且每个周期均有优质胚胎移植着床失败及Yoshioka等[5]提出排除卵巢储备功能减退患者且≥4个周期胚胎移植着床失败；2007年Rinehart[6]把RIF定义为移植≥8个8细胞胚胎或≥5个囊胚未妊娠；2008年Kling等[7]提出≥3个周期胚胎移植未妊娠；2012年Simon等[8]提出≥3个周期，每个周期1～2枚优质胚移植未着床；2014年Coughlan等[1]提出RIF是指年龄小于40岁妇女，≥3个周期，≥4个优质胚胎移植未妊娠，同年Polanski等[9]提出≥2个周期，≥4个优质卵裂期胚胎或≥2个囊胚移植而未获临床妊娠；2015年Santillán等[10]提出≥3个周期，每个周期≥1个优质胚胎移植未妊娠；2017年Macklon[11]提出≥3个周期，≥10个优质胚胎移植未妊娠，尽管卵巢反应良好且无子宫病变；2018年Cao等[12]认为≥2个周期移植未妊娠，每个周期均有优质胚胎定义为RIF。

2 RIF诊断标准的争议

2.1 移植胚胎周期数 在胚胎移植周期数方面，分别有2[2，9，12]、3[1-4，7-8，10-11]、4[2，5]、5[2]、6个周期[2]等纳入标准。在辅助生殖技术不成熟和成功率较低时，RIF定义的移植胚胎周期数多处于较高水平，如2005年Tan等[2]定义RIF为2～6个周期及以上移植周期着床失败。而后随着辅助生殖技术水平的进步，在RIF的诊断中移植胚胎周期数呈现逐渐减少趋势。如Polanski等[9]对涉及RIF定义的文献进行了综述，发现最常见的RIF定义是“3个周期及以上治疗周期失败”和“2个周期及以上治疗周期失败”，如Thornhill等[3]、Margalioth等[4]提出的经历3个周期及以上种植失败为RIF；Polanski等[9]、Cao等[12]提出的经历2个周期及以上种植失败为RIF。2个周期或者3个周期移植失败是RIF诊断存在争论的热点问题。

但是，2018年Somigliana等[13]通过数学模型推断出：基于不高的体外受精（IVF）成功率，在1个预后良好的标准人群中，3个助孕周期后RIF的假阳性诊断率仍＞50%，经过6个助孕周期后诊断才变得可靠，认为用“3个周期助孕失败”定义RIF会导致过度诊断，并有可能导致过度治疗。

2.2 移植胚胎数量及质量

2.2.1 移植胚胎数量 在移植胚胎的数量上，分别有文献将3[4]、4[1，9]、5[6]、8[6]、10个[2-3，11]胚胎纳入标准。大多数学者认为移植胚胎的数目越多，妊娠率也越高，故为提高成功率单次移植胚胎数目多大于3枚，在此背景下，2005年，Tan等[2]、Thornhill等[3]将RIF定义为移植≥10个胚胎未妊娠。在当时胚胎植入率较低的情况下，该定义被应用于临床。而后随着促排卵方案和胚胎培养策略的不断改进以及对预防多胎妊娠以及其他并发症发生的重视，单次移植胚胎数量多控制在1个或2个，如2017年美国生殖医学会（ASRM）在指南中指出：应鼓励35岁以下的患者接受单胚胎移植，无论胚胎处于哪个阶段；对于35～37岁的患者，应强烈考虑单个胚胎移植；对于38～40岁的患者，移植的卵裂期胚胎或囊胚不应超过3个[14]。故在RIF的诊断中移植胚胎数目亦呈现下降趋势，如2012年Simon等[8]将RIF定义为移植3个周期及以上，每次移植1～2个优质胚胎未妊娠。

2.2.2 移植胚胎质量 移植高质量胚胎是RIF诊断的必要前提，胚胎质量是影响胚胎种植率的关键因素之一。故大多数学者均将移植优质胚胎纳入RIF的诊断中，如Tan等[2]、Margalioth等[4]。在移植胚胎质量评估方面，目前世界上绝大多数实验室采用的仍然是传统的形态学评估方法，从细胞数量、碎片率以及均一性等方面来评价胚胎[15]，但判定标准尚不统一，并且与实验室人员技术水平密切相关，这也为规范化的RIF定义增加了困难。有研究将D3、卵裂球匀称、碎片率小于10%的7～8细胞的胚胎定为优质胚胎。优质囊胚则根据Gardner and Schoolcraft分级体系被评判为D5、3～5级、AA、AB或BA的囊胚[16]。通过形态学评估胚胎质量筛选出优质胚胎可提高妊娠率，降低RIF发生率，故RIF诊断中应将胚胎质量考虑在内。但随着研究的深入和技术的发展，胚胎学家们认识到传统的形态学评估只是在固定的几个时间点对胚胎进行观察，并不能完全反映胚胎发育潜能的真实情况，故有研究通过探讨延时摄影（time-lapse）技术的胚胎动力学参数与妊娠结局的关系，认为time-lapse技术可捕捉到胚胎早期发育过程中异常分裂事件的发生，从而初步建立了一种优胚选择模型[17]。

2.3 移植胚胎期别与周期类型

2.3.1 移植胚胎期别 随着体外培养技术的不断改进，胚胎可在体外发育至囊胚阶段。2007年Rinehart[6]将RIF定义为移植≥8个8细胞胚胎或≥5个囊胚未妊娠，将不同的胚胎期别纳入RIF诊断标准中。胚胎期别可影响妊娠率，现普遍认为卵裂期D2移植发育为4细胞胚胎可以获得较高的妊娠率，D3移植≥8细胞胚胎妊娠率显著高于＜8细胞胚胎[18-19]，囊胚的妊娠率高于卵裂期胚胎，如Glujovsky等[20]证明了囊胚移植的临床妊娠率及活产率明显优于卵裂期移植，并且Xing等[21]认为囊胚期胚胎更符合自然生理现象，具有更好的发育潜能，子宫内膜容受性更高。故将胚胎期别纳入RIF诊断标准中更合理。有研究已发现囊胚移植对RIF患者有益，如Zhang等[22]将575例RIF患者随机分为囊胚期移植（SBT）和卵裂期胚胎移植（DET）两组，证明SBT组临床妊娠率、植入率、持续妊娠率高于DET组，SBT可作为RIF患者的首选治疗策略。由于单囊胚移植在胚胎种植率和降低多胎妊娠率等方面具有优势，故学者们将囊胚移植数量纳入RIF的诊断标准。此外，单囊胚移植与2个卵裂阶段胚胎的移植具有相似的活产率[23]，因此，将单个囊胚的发育潜力等同于2个分裂阶段胚胎的发育潜力，在定义RIF时也应考虑这一因素。如Polanski等[9]将RIF定义为移植不少于4个优质卵裂期胚胎或者2个囊胚而未着床。

2.3.2 新鲜胚胎移植或冻融胚胎移植 根据所移植胚胎的不同，胚胎移植可分为新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植（FET）2种方式。随着卵巢刺激和胚胎冷冻保存方案的改进，以及倾向于移植更少的胚胎，增加了胚胎冷冻的概率，FET已成为鲜胚移植的重要补充，一次取卵多次移植可以增加患者的累积妊娠率，在定义RIF时应将其考虑在内。但有些学者曾将FET周期排除在RIF定义之外，如Tan等[2]在定义RIF时只考虑到移植胚胎的周期数、数量以及质量，而未明确将新鲜或者冻融胚胎移植周期纳入诊断标准中。有证据表明冻融胚胎的着床率与新鲜胚胎相似，如Wong等[24]通过Meta分析比较FET和鲜胚移植的临床结局，发现两者的临床妊娠率、持续妊娠率及活产率无显著差异，FET组流产率低于鲜胚移植组。因此，应将胚胎移植的周期包括新鲜和冷冻周期考虑到RIF的诊断中，例如Polanski等[9]提出的“经历至少2个新鲜周期或冻融周期，共移植不少于4个优质卵裂期胚胎或者2个囊胚而未获临床妊娠”。

2.4 年龄 2014年以前的学者在定义RIF时并未将患者年龄纳入诊断标准中，只有2006年Yoshioka等[5]在RIF定义中提出应排除卵巢储备功能减退，证明学者们已认识到卵巢功能与RIF的发生有关，并且年龄是影响卵巢功能最主要的因素。1991年已有研究发现，年龄可以作为影响患者最终妊娠结局的一个独立因素，女性生育力随年龄增长而下降[25]。Bashiri等[26]亦将患者年龄作为RIF的危险因素单独提出。患者年龄对胚胎质量起着至关重要的作用。妊娠率也会随着患者年龄的增加而降低，特别是Haight等[27]发现，影响妊娠结局的主要因素是患者年龄。另有研究表明，FET的妊娠率会随着患者年龄的增加而下降，尤其是大于40岁的患者[28]。故2014年Coughlan等[1]不仅在移植的周期数和胚胎数上进行了界定，还提出患者年龄和复苏周期移植也应考虑在内。随着社会的发展，工作和生活压力日益增高，女性生育年龄逐渐推后，2015年我国全面两孩政策放开，越来越多的高龄女性加入到计划二胎的队伍中来，故将年龄纳入RIF的诊断标准被中国很多学者所认可。

3 结语

综上所述，现在RIF的诊断标准尚不明确，对RIF缺乏一个一致的、标准化的定义是一个国际性的问题，现有的建议诊断标准均来源于文献及专家意见，缺乏坚实的科学依据，主要存在移植胚胎周期数、移植胚胎数量及质量、移植胚胎期别与周期类型、年龄等方面的争议。随着辅助生殖技术的进步，为降低多胎妊娠率以及其他并发症的发生率，单胚胎移植以及优先囊胚移植的发展趋势，使得RIF诊断中移植周期数和数目逐渐减少，并且要求优质胚胎，包含新鲜或者冷冻周期，年龄有所限制。在快速扩大的RIF领域开展高质量的研究迫在眉睫。由于每个生殖医学中心的RIF患者数量很少，为了确定规范标准化的诊断标准，应进行多中心、高质量的国际化研究。