基于高通量分析方法的长江干流重庆段抗生素种类特征及来源初探

石运刚，卓丽，陈静华，蒋小萍，蔡凤珊，严骁，郑晶，钟昌琴,*，刘嘉烈

1. 重庆市固体废物管理中心，重庆 400020 2. 国家环境保护环境污染健康风险评价重点实验室，环境保护部华南环境科学研究所，广州 510655 3. 西南石油大学，成都 610500

抗生素一般指能够杀灭或抑制微生物的一类次级代谢产物，广泛应用在人类疾病防治、水产养殖和畜牧养殖中[1]。由于人和动物对抗生素的吸收效率低，大部分抗生素以原药或代谢产物的形式被直接排出体外，进入水体等环境介质[2-3]。目前在多种水体环境中均有抗生素检出，包括污水处理厂进出口废水、养殖废水、地表水、地下水、甚至饮用水源[4-9]。

在长江流域已检出多种抗生素，主要包括磺胺嘧啶和红霉素等[10]，唐娜等[11]在长江南京段表层水体中共检出8种磺胺类化合物。孙雨等[12]在长江南京段水源地水样中检测到四环素、红霉素、罗红霉素和氯霉素。封丽等[13]在三峡库区主要水域包括长江干流和6条支流水体中检出磺胺类、大环内酯类、氟喹诺酮类和其他类等4类抗生素。长江干流重庆段处于长江水系的上游，是长江经济带的重要组成部分，其流域范围内工农业发达，上游服务于农业、畜牧业发达的青海、甘肃等地，下游服务于经济繁华、人口密集的上海、江苏等地，其抗生素污染值得重点关注。

目前，靶向分析方法仍然是环境中抗生素识别的主要方法[14]。李红英等[15]通过建立快速筛查数据库同时测定化妆品中的6种抗生素类化合物，王培锋等[16]建立了动物源食品中31种抗生素的快速筛查方法。尽管这些方法可以检测几百种物质，但是靶向分析涵盖的种类仍不够，如需对多种类污染物同时分析，仍然存在耗时费力等缺点，难以达到污染物快速筛查的目的，为弥补靶向分析的不足，非目标分析的高通量筛查方法应运而生[17]，如可疑物筛查方法和非靶向筛查方法，针对种类繁多、结构复杂的污染物可实现快速定性定量分析。郭惠卫等[14]通过建立有毒有害物质快速筛查方法在固体废弃物样品中成功地鉴定出6种危废物质。

本研究采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用技术(LC-QTOF/MS)，构建抗生素筛查数据库，对重庆市的11个断面水体、2个市政污水处理厂进水和6个养殖场未处理废水中的潜在抗生素进行了筛查，了解了重庆市流域抗生素污染情况，并结合抗生素使用调查，分析了流域抗生素的排放源，为长江干流重庆段抗生素监测和管理提供重要依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 采样点的布置和样品采集

本次调查时间为2018年6—7月，水样采自长江干流重庆段，以及汇入长江干流的嘉陵江和乌江的11个流域断面(W1～W11)、2个污水处理厂进水口(W12～W13)和6个养殖场(W14～W19)。采样布点情况见表1、表2和图1。市政污水处理厂选择原则为废水排放量大、服务人口多、服务区域内医院集中的，采集废水处理设施进水口的水样，采集量为1 L。重庆市的畜禽养殖以猪、牛、羊和鸡为主，水产养殖以四大家鱼为主，因此，在重庆市主要养殖区域选择了8家规模较大的典型养殖场，各采集未处理废水1 L。在每个流域断面的左中右水面下0.5 m处分别采集水体，共采集2 L水体，在棕色玻璃瓶混合均匀后，加入50 mL色谱纯甲醇和400 μL 4 mol·L-1H2SO4，样品避光冷藏运回实验室，并在48 h内处理。

表1 流域采样位点基本信息Table 1 Basic information of sampling sites in the basin

图1 采样位点分布图Fig. 1 Distribution map of sampling sites

表2 污水处理厂和养殖场采样位点基本信息Table 2 Basic information of sampling sites in sewage treatment plants and farms

1.2 样品预处理及仪器分析

1.2.1 样品预处理

水体样品过GF/F滤膜(直径142 mm，孔径0.7 μm)后进行固相萃取。预先用甲醇、超纯水各10 mL活化HLB小柱，加入2 mL pH=3的稀盐酸缓冲液，样品以5 mL·min-1的流速进行萃取。用10 mL甲醇洗脱HLB小柱，洗脱液用氮吹吹干，以1 mL甲醇定容，0.22 μm滤膜过滤后，贮存于棕色进样瓶中。

1.2.2 仪器分析

Agilent 1290 LC液相色谱，Agilent 6545 QTOF/MS四级杆/飞行时间质谱仪，采用电喷雾离子源，正负离子(ESI±)全扫描模式，m/z范围50～1 000。采用C18反相高效液相色谱柱，流动相(正负模式相同)中，A为5 mmol·L-1乙酸铵+0.05%甲醇水溶液(体积比)；B为甲醇；正模式流速为0.3 mL·min-1，负模式流速为0.4 mL·min-1，进样体积为10 μL；柱温为45 ℃；碰撞气为氮气进行梯度洗脱。正负洗脱梯度如下：正模式中A流动相以70%保持8 min后，在16 min内由70%降至50%，再在18 min内降至10%并保持6 min，总分析时间48 min；负模式下A流动相以70%保持4 min后，在8 min内由70%降至50%，再在8 min内降至10%并保持4 min，总分析时间为24 min。

1.3 样品检测

1.3.1 数据库的建立

实验室已有57种常见抗生素标准品，另外从“国家基本药物目录”、“农业部兽用处方药品种目录”、“食品动物用兽用抗菌药物临床应用分级管理目录”中筛选出其他256种无标准品的抗生素，建立共313种目标抗生素的筛查数据库。

在Agilent-PCDL软件中录入有标准品的抗生素信息，包括保留时间、精确质量数以及对应的一级质谱和二级质谱数据，构建有标准品的抗生素筛查数据库。对于无标准品的抗生素，通过Agilent-PCDL软件录入分子式、CAS号、精确分子质量数以及化学结构式，构建无标准品的抗生素筛查数据库。

1.3.2 样品检测

共检测23个样品，包括2个质量控制样品(1个程序空白和1个溶剂空白)，11个流域水体样品、2

个污水处理厂进水样品和6个养殖场未处理废水样品。除甘宝素和倍他米隆在程序空白中有检出且响应值远远低于其他检出样品外，其余所有抗生素在程序空白和溶剂空白中均无检出，这表明实验过程的误差得到了控制。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 抗生素识别

2.1.1 流域水体检出抗生素

由图2可知，在11个流域水体中共检出38种抗生素，其中抗病毒药类检出数量最多，其次是大环内酯类、磺胺类、抗真菌药、喹诺酮类和其他类，这6类抗生素检出数量占比达73.68%，为主要检出类别。与已有的相关研究结果比较可以看出，以往报道在地表水中检测到的抗生素类型主要为大环内酯类和磺胺类，这与本研究结果一致(表3)。结合已有报道和本研究结果，可以认为大环内酯类和磺胺类在我国地表水中是一种普遍存在的抗生素。而抗真菌药和喹诺酮类可能为长江干流重庆段水体中的特征抗生素类型。11个流域检出抗生素的数量和类别存在差异，这与流域沿岸企业的分布相关。流域水样与污水处理厂和养殖场检出的抗生素的类别组成相似，这表明污水处理厂和养殖场产生的废水最终排入流域内，造成流域内抗生素的积累。刘晓晖[20]对洞庭湖湖体中抗生素的污染来源进行了初步探究，发现湖体中抗生素的主要来源为污水处理厂和养殖废水。

2.1.2 污水处理厂和养殖场检出抗生素

由图3(a)可知，2个污水处理厂进水和6个养殖场未处理废水中共筛查获得70种潜在抗生素，其中喹诺酮类检出数量最多，其次是氨基糖苷类、磺胺类、大环内酯类、抗结核病药类、抗病毒药类和其他类，这7种类型的抗生素检出数量占比达70%，为主要检出类别。检出率较高的抗生素类别均是较为常用的广谱抗菌药物，被广泛应用于医疗、畜牧养殖等行业中[21-22]。

由图3(b)可知，2个污水处理厂进水中分别检出抗生素36种和40种，以喹诺酮类、大环内酯类、头孢菌素类和磺胺类为主。这几类抗生素使用历史较久，是目前临床上常用的抗生素种类[23]，如氧氟沙星、诺氟沙星、头孢氨苄和红霉素等是常规抗菌药物，被广泛用于多种疾病的消炎杀菌中，在医院废水中普遍被检出[24]。市政污水处理厂进水中抗生素的主要来源为医疗废水以及生活废水的排放，其抗生素使用范围更为广泛，用量更大，因此其检出的抗生素种类相对较多[25]。6个养殖场废水共检出抗生素4～22种，以喹诺酮类和磺胺类为主。京津冀地区畜禽养殖废水中检出的主要抗生素也为磺胺类和喹诺酮类[26]。6个养殖场检出类别和数量不同，这与抗生素药物的使用量和养殖品种有关。妥布霉素仅在W15有检出，妥布霉素用于山羊眼睛结膜炎的治疗[27]。卡那霉素和喹乙醇仅在W18有检出，卡那霉素可用于家禽的菌血症、败血症、呼吸道感染和腹膜炎等治疗[28]。W19点位检出抗生素数量最少，仅磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、奥司他韦和甘宝素4种，这与水产养殖场中抗生素的使用量较少和流水稀释作用等相关[29]。

2.1.3 水体中抗生素的空间分布

长江干流重庆段抗生素的检出数量分布如图4所示，抗生素检出数量水平的空间差异明显。在7个长江流域断面中，抗生素的检出数量为13～26，最高点位于W7(长江干流出境断面)，最低点位于W4(国控考核断面)。长江干流重庆段的抗生素检出数量在空间上整体表现为上游(W1～W2)<中游(W3～W5)<下游(W6～W7)，这与沿岸污水处理厂和养殖场的分布有关。沿岸的污水处理厂和养殖场将含有高浓度抗生素的废水排入长江，导致长江干流水体中可检出抗生素数量增多[12]。由于支流水体自净能力远低于干流，水体中抗生素的残留浓度受水文条件影响较显著[13]，嘉陵江水体中抗生素的检出数量略高于长江，并且支流入境断面抗生素的检出数量均低于支流的汇入断面。此外，养殖厂对抗生素的持续使用，可能造成某些采样点位的抗生素浓度偏高[12]。

2.2 出入境断面水体中检出抗生素的分析

由图5可知，3个入境断面(W1、W8和W10)共检出28种抗生素，出境断面(W7)共检出26种抗生素。22种抗生素在入境断面和出境断面均有检出，表明长江干流重庆段出境断面可能受河流径流输入的影响“接收”了入境断面的大部分抗生素[30]；其中，甘宝素、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、脱水红霉素、罗红霉素、氟苯尼考、倍他米隆、环吡酮胺和洛匹那韦10种抗生素在3个入境断面均有检出，克拉霉素、红霉素、西诺沙星和斯塔夫定由断面W8携带入境，氟康唑由断面W10携带入境，氧氟沙星、对氨基水杨酸、依沙酰胺、氟胞嘧啶、奈替米星和替比夫定这6种抗生素在入境断面检出而未在出境断面检出，这与水稀释、自然降解等作用有关[29]。泰勒菌素、头孢沙定、奥司他韦和哌拉西林4种抗生素在出境断面检出而未在入境断面检出，可能是与重庆市内的生产活动排放有关。

图2 流域水体抗生素检出情况注：a. 总体检出类别； b. 各个采样点检出情况。Fig. 2 Identified antibiotics in the basin Note: a. Total category; b. Identified antibiotics at each sampling site.

图3 污水处理厂和养殖场抗生素检出情况注：a. 总体检出类别； b. 各个采样点检出情况。Fig. 3 Identified antibiotics in the sewage treatment plants and farms Note: a. Total category; b. Identified antibiotics at each sampling site.

图4 长江流域重庆段抗生素污染分布特征Fig. 4 Distribution of identified antibiotics in the Chongqing section of Yangtze River

2.3 检出抗生素的溯源分析

由图6可知，流域内共检出抗生素36种，入境断面共检出抗生素28种，污水处理厂和养殖场共检出抗生素70种，污水处理厂和养殖场检出抗生素数量明显高于流域境内，说明医疗用药和兽用药是抗生素最主要的来源[20]。

表3 中国地表水中抗生素的浓度Table 3 The reported concentration of antibiotics in surface water in China

图5 出入境断面抗生素相互关系韦恩图注：W1、W8和W10是入境断面，W7是出境断面。Fig. 5 Venn diagram of antibiotics at the exit and entry sections Note: W1, W8 and W10 are entry sections; W7 is exit section.

图6 抗生素相互关系韦恩图Fig. 6 Venn diagram of antibiotics from different sources

对于本研究，甘宝素、氟康唑、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、甲氧苄啶、氧氟沙星、克拉霉素、红霉素、脱水红霉素、罗红霉素、林可霉素、对氨基水杨酸、倍他米隆、环吡酮胺、西诺沙星、依沙酰胺、呋布西林、洛匹那韦和曲氟沙星这20种抗生素是通过上游携带和重庆市内排放引入这2种方式进入流域的。磺胺氯哒嗪、氟苯尼考、阿糖腺苷、乙酰甲喹、奈替米星、斯塔夫定和替比夫定由上游携带入境；泰勒菌素、头孢沙定、奥司他韦、庆大-小诺霉素和磺胺米隆由重庆市引入长江，这5种抗生素通常在医疗和养殖行业废水中检出[31]；吗啉胍、夫西地酸、西卡宁和哌拉西林4种抗生素只在流域检出，表明这4种抗生素可能是由重庆市内的其他排放源引入长江，这4种抗生素药物常在医疗废水中检出[32]。此外有45种抗生素只在污水处理厂和养殖场废水中检出，可能是由于排水取向、使用量较少以及水流稀释作用等未在流域中检出[33]。

本研究基于建立抗生素数据库和高通量分析方法，在长江重庆段水体、污水处理厂进水和养殖场未处理废水中成功筛查获得83种抗生素，其中磺胺间甲氧嘧啶检出率最高，喹诺酮类是检出的主要抗生素类型；并且结合重庆市抗生素的生产使用情况，分析了抗生素的种类分布特征和主要来源。但高通量分析方法只能对抗生素进行定性分析，因此本研究的讨论仅基于检出种类和检出率。在后续的研究中，将对已检出的抗生素进行定量分析和风险评估，为流域开展抗生素监测和管理提供重要的理论支持。