不同性别MTHFR基因多态性协同叶酸水平差异对血清同型半胱氨酸的影响研究

舒 放，王海峰，薛飞肖，宁 可，史珊珊，吕海港

1.西安市第三医院检验科(西安 710018)；2.西安市红会医院麻醉科(西安 710054)

始于1976年的众多流行病学研究表明，高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)是心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVDs)的独立危险因素[1]。同型半胱氨酸(Hcy)是氨基酸半胱氨酸的异种，其代谢作用有两种途径：再甲基化和转硫作用。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是再甲基化循环中的关键调控酶[2]，在Hcy代谢过程中起到重要作用。人MTHFR催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原(5,10-MTHF)为5-亚甲基四氢叶酸(5-MTHF)，5-MTHF是同型半胱氨酸甲基化成蛋氨酸中起重要作用的因子。人类MTHFR基因位于染色体1p36.3，全长1980bp，MTHFR基因第4外显子上的第677位核苷酸(C677T，rs1801133)的胞嘧啶(C)替代胸腺嘧啶(T)是一个常见的MTHFR基因多态性[3]，由此存在三种基因型：MTHFR C677C(野生型)、MTHFR C677T(杂合突变型)、MTHFR T677T(纯合突变型)，突变使得再甲基化循环障碍，从而导致Hcy在体内蓄积，血清Hcy水平升高[4]。有研究表明， 血清Hcy水平易受B族维生素(叶酸、维生素B12和维生素B6)调节[5]。叶酸缺乏亦会提高Hcy水平和高同型半胱氨酸血症的发病率[6-7]。此外，补充叶酸有助于降低高Hcy浓度的毒性并受到MTHFR基因型调控[8-9]。本文着重探讨叶酸缺乏合并Hcy代谢基因多态性对血清Hcy水平的影响以及性别因素的差异性。

材料及方法

1 标本采集 筛选西安市第三医院2017年2-7月间住院病人病例共88例，其中男性39例，女性49例，年龄18～85岁，均来自健康管理中心。收集病例年龄、性别、血压、等数据。血清学检测排除溶血、严重脂血、黄疸等影响因素。

2 血清学检测 早8:00-9:00间采集静脉血4ml，3000r/min离心15min，分离血清，4℃可保存3d，长期保存需-20℃冻存。Beckman AU5800全自动生化分析仪检测血清葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、Hcy，以上检测项目需离心后2 h内检测； Unicel DXI 800化学发光分析仪检测血清叶酸(Fol)。样本检测当日仪器均运行正常，质控在控，CV<5%。

3 MTHFR基因多态性检测

3.1 全血基因组DNA提取试剂盒分离全血中的基因组DNA。

3.2 每人分做两个反应体系，分别含有C677T基因突变型特异引物及野生型特异引物。每个反应体系包括29μl扩增液、1μl反应液(含Taq DNA酶、UNG酶)、3μl待测基因组DNA、17μl ddH2O补至总体积50μl。

3.3 等位基因特异性聚合酶链反应(Allele Specific PCR,AS-PCR)。Roche cobas®480全自动荧光定量PCR分析仪进行基因扩增。扩增程序为50℃ 2min；95℃ 5min；94℃ 30s、60℃ 30s、65℃ 1min(26Cycles)；65℃ 10min；4℃ Hold。

3.4 将两管扩增产物分别滴在检测卡对应的样品垫处，2～5min根据在线检测线(T线)是否出现条带判读C677T位点的基因型。C/C为野生型，C/T为杂合突变型； T/T为纯合突变型。

4 统计学方法 应用SSPS19.0统计学软件，t检验分析不同性别基本临床参数(Glu、TG、BP、Hcy、Fol)差异性及MTHFR基因多态性分布差异；不同性别MTHFR基因多态性合并血清叶酸不同水平时血清Hcy水平差异性。

结 果

1 不同性别基本临床参数的比较 见表1。基本参数如血压、Glu、TG、TC在不同性别间比较均无统计学差异(P>0.05)，Fol水平在不同性别间有统计学差异性(P<0.05)，女性Fol高于男性。

2 不同性别MTHFR基因多态性分布 见图1。 C/C野生型占14.8%，C/T杂合突变型占47.7%；T/T纯合突变型占37.5%，不同性别间比较无统计学差异(P>0.05)。

3 MTHFR C677T基因多态性Hcy、Fol水平比较 见表2。三种MTHFR基因多态性样本组间血清Hcy水平比较有统计学差异。

4 不同性别MTHFR基因多态性合并叶酸缺乏者血清Hcy水平比较 见表3。不同性别叶酸缺乏组间血清Hcy水平比较，有统计学差异。

表1 不同性别基本临床参数

注：本组不同性别比较，*P值<0.05

表2 MTHFR基因多态性合并血清叶酸不同水平时血清Hcy水平比较

注：Fol测定值≥5.9nmol/L入Fol不缺乏组，<5.9nmol/L入Fol缺乏组；与Fol缺乏组比较，*P<0.05

表3 不同性别MTHFR 基因多态性合并叶酸缺乏者Hcy水平比较

注：与本组不同性别比较，*P<0.05

图1 不同性别MTHFR基因多态性分布

讨 论

HHcy可能导致动脉粥样硬化这一观点最初是1969年由Mc Cully在一项对儿童蛋氨酸代谢障碍的研究中首次提出[10]。此后，几十年来，许多研究试图揭示Hcy对CVDs的致病机理以及探讨这种相关性是否适用于不同人群[11-13]，目前绝大多数的研究都证实了这一观点。而另一些研究观点认为Hcy可能是CVDs的标志物而不是诱因[14]。此外，其他一些临床及流行病学研究发现异常HCY也可能在糖尿病、内皮功能障碍、先天性缺陷和认知障碍的过程中发挥作用[15-16]。MTHFR 677基因多态性还同复发性流产(Recurrent pregnancy loss，RPL)密切相关，其中基因位点C→T突变可造成孕妇血同型半胱氨酸水平上升，造成胎儿发育障碍，引起流产风险上升[17]。

MTHFR是调节Hcy代谢的关键酶，其中677基因位点突变造成MTHFR的一个基因多态性(SNP rs1801131)。从人外周血细胞中提取基因组DNA的方法，通过对等位基因MTHRF C677T基因突变位点的引物设计及标记，利用等位基因特异性聚合酶链反应(Allele Specific PCR,AS-PCR)方法扩增获得特定的扩增片段，标记有地高辛分子的PCR产物在与所构建的基因分型检测体系中纳米金磁微粒表面抗地高辛单抗相互作用，通过侧向流层析技术实现MRHFR C677T基因多态性的检测。相应的中国人群MTHFR 677纯合突变率高达29%，杂合突变高达44%，正常MTHFR 677CC基因型(野生型)仅占27%。无论是杂合突变(677CT)或纯合突变(677CC)都造成酶活性的减低，从而影响Hcy代谢，造成体内堆积。血浆Hcy水平受遗传和环境因素的影响。而在这些因素中，血清叶酸是同型半胱氨酸升高最强的独立因素。临床研究显示，叶酸口服可有效治疗高同型半胱氨酸血症[18]。故叶酸的缺乏被认为是心血管疾病的一个危险因素。除此之外，米蔓丽等[19]研究指出，可对RPL患者同时进行MTHFR基因多态性和空腹同型半胱氨酸筛查，以对其流产风险进行评估，并及早采取干预措施。

本研究中，受试者年龄、收缩压、舒张压、Glu、TG、TC等连续变量均为平均数±标准差。血清Hcy水平高于15μmol/L被定义为HHcy[20]，血清叶酸水平低于5.9 nmol/L作为叶酸缺乏判断标准。与女性相比，男性表现出较高的收缩压、舒张压及血清Hcy水平(P<0.05)，较低的血清叶酸水平(P<0.05)。与MTHFR 677CC 及 MTHFR 677CT携带者相比，MTHFR 677TT基因型的患者有较高的血清Hcy水平(P<0.05)。不同性别MTHFR基因C677T多态性联合叶酸缺乏对Hcy水平的影响主要体现在T677T型别，由于这种纯合突变本身更易造成叶酸代谢障碍，从而导致Hcy水平升高。结合性别因素，男性较女性叶酸水平整体偏低，叶酸水平及MTHFR 677基因型二者共同影响下造成男性MTHFR基因纯合突变者其血清Hcy水平与女性比存在显著性差异。而在MTHFR基因多态性C677C和C677T两型受检者的血清Hcy无明显性别差异性，原因除了该两种基因型决定了叶酸代谢水平应比T677T型高外，环境因素和饮食因素可能在叶酸摄取及Hcy水平方面也起到一定作用，弱化了该两种基因型的血清Hcy在性别间的差异性。

综上所述，MTHFR 677三种基因型中纯合突变(TT)型者更易造成血清Hcy代谢障碍，此类型的基因型个体合并叶酸缺乏者其血清Hcy升高。故MTHFR T677T型尤其是男性更应注重叶酸的摄取及补充，降低HHCY的风险概率。