正交设计法优化盐肤木根总酚酸的提取工艺

何大青 ，叶永华 ，方泗杨 ，杨 玲 ，许 文 ，叶 淼 ，郑海音 ，徐 伟

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

盐肤木（Rhus chinensis Mills.）为漆树科（Anacardiaceae）盐肤木属（Rhus）落叶小乔木，在我国除东北、内蒙古和新疆外，其余省区均有分布［1］。盐肤木的现代研究多集中于药食两用的盐肤木果［2-4］和其虫瘿（中药名称为五倍子）［5］，而对于盐肤木（五倍子树）药材的其他用药部位研究较少。根据福建省中药材标准和广东省药材标准，盐肤木用药部位为其干燥根、茎，中医理论认为其可固阳补血、壮筋祛湿，临床用于消肿、清热解毒、活血化瘀等［6-7］。福州海王金象中药制药有限公司以盐肤木作为单方制剂开发了舒冠通糖浆，临床上用于抗冠心病治疗，疗效确切［8］。

然而，查阅国内外文献研究情况，目前对盐肤木药材化学成分的提取研究很少，仅有针对黄酮类成分的提取工艺研究［9-10］，而从课题组前期的盐肤木化学成分分离鉴定结果来看，盐肤木中高含量成分多为酚酸类成分［11］。现代药理研究表明酚酸类成分具有良好的抗氧化、抗炎和神经保护作用［12］，可能是盐肤木或者舒冠通糖浆的重要药效物质基础，并且课题组查阅文献，以盐肤木中总酚酸类部位进行提取工艺的研究鲜见报道。因此本研究拟采用针对盐肤木中总酚酸的部位，以其含量作为评价指标，采用正交设计法优化盐肤木总酚酸的提取工艺，为盐肤木总酚酸部位的现代中药开发利用以及合理、经济、简便工业化生产工艺提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津UV-1800型可见分光光度计（日本岛津公司）；CPA225D型十万分之一天平（德国Sartorius公司）；HC-2068高速离心机（安徽中佳科学仪器有限公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DFY-500型中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

1.2 材料 盐肤木（批号：15122201）由安徽协和成药业饮片有限公司提供，经福建中医药大学药用植物学实验室范世明鉴定为漆树科盐肤木属盐肤木（Rhus chinensis Mills）的干燥根，其标本（编号：YFM 20151003）存放于福建中医药大学生物医药研发中心标本室；没食子酸（纯度≥92.0%，中国食品药品检定研究院，批号：110831-201204）；碳酸钠、磷钼钨酸、乙醇购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取没食子酸对照品12.5 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加水充分溶解并稀释至刻度，充分摇匀；再精密量取5 mL至50 mL量瓶中，并加水定容，摇匀，即得0.05 mg／mL对照品溶液。

2.2 含量测定 参照文献［13］测定。

2.2.1 标准曲线的建立 精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于 25 mL 棕色量瓶中，依次分别加入1 mL磷钼钨酸试液，再分别加入11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL 水， 最后加入 29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，静置35 min，以同样方法处理试剂为空白显色体系，在760 nm波长处测定吸光度。以吸光度（Y）对浓度（X）为进行线性回归计算，绘制标准曲线，得线性方程：

结果表明：没食子酸在1.0～10.0 μg／mL范围内，线性关系良好。

2.2.2 总酚酸测定 精密吸取各工艺考察的样品溶液0.5 mL置于25 mL棕色量瓶中，依次加入1 mL磷钼钨酸试液、11.5 mL水，最后用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，静置35 min，以同样方法处理试剂为空白显色体系，在760 nm波长处测定吸光度，代入标准曲线，计算总酚酸含量。

2.3 盐肤木总酚酸提取工艺研究

2.3.1 单因素考察

2.3.1.1 评价指标 以总酚酸提取率为评价指标进行各提取工艺考察。

2.3.1.2 乙醇提取浓度对总酚酸提取率的影响 精确称取盐肤木粉末5.0 g，置于圆底烧瓶，提取液料比15∶1，乙醇提取溶剂比例分别设置为40%、50%、60%、70%、80%，浸泡 30 min，回流提取 1 h，按照方法“2.2”项下测定盐肤木中总酚酸的含量，结果见图1。在40%～70%乙醇浓度，总酚酸提取率与乙醇提取浓度成正相关，在70%乙醇浓度时总酚酸提取率达到峰值，但在70%乙醇浓度之后，总酚酸提取率随着乙醇提取浓度的升高而降低。初步确定乙醇提取浓度为50%～70%作为进一步正交考察的水平。

2.3.1.3 液料比对总酚酸提取率的影响 精确称取盐肤木粉末5.0 g置于圆底烧瓶中，分别加入5、10、15、20、25 倍量的 70%乙醇浸泡 30 min，回流提取1 h，按照方法“2.2”项下测定盐肤木中总酚酸的含量，结果见图1。总酚酸的提取率随着液料比的增大而增大，在液料比为20∶1后，总酚酸的提取率基本保持不变。因此选择液料比为15∶1～25∶1作为进一步正交考察的水平。

2.3.1.4 提取时间对总酚酸提取率的影响 精确称取盐肤木粉末5.0 g置于圆底烧瓶中，加入20倍量的70%乙醇，浸泡30 min后，回流提取时间分别设置为 30、60、90、120、150 min，按照方法“2.2”项下测定盐肤木中总酚酸的含量，结果见图1。总酚酸提取率随着提取时间的增加而逐渐上升，在提取时间为120 min之后总酚酸的提取率基本不变。因此选择提取时间为60～120 min作为进一步正交考察的水平。

2.3.1.5 回流提取次数对总酚酸提取率的影响 精确称取盐肤木粉末5.0 g置于锥形瓶中，加入20倍量的70%乙醇，浸泡30 min，回流提取1 h，提取1、2、3、4 次，按照方法“2.2”项下测定每次盐肤木提取液中总酚酸的含量，结果见图1。随着提取次数的增长，总酚酸提取率逐渐降低，在提取3次之后，总酚酸的提取率已提取完全。因此确定提取次数为1～3次作为进一步正交考察的水平。

图1 提取影响因素考察结果

2.3.2 正交设计试验法 结合单因素实验结果，利用DPS 14.0软件正交设计试验，选用L9（34）正交试验方案，以乙醇提取浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）及提取次数（D）为考察因素，以总酚酸提取率为评价指标，结果见表1。

试验结果表明：以总酚酸含量为评价指标，经极差分析可知，总酚酸提取率的影响因素的顺序分别为：C＞B＞D＞A，对A因素，其优劣次序为A3＞A1＞A2；对 B 因素，其优劣次序为 B2＞B3＞B1；对 C因素，其优劣次序为C2＞C3＞C1；对D因素，其优劣次序为 D2＞D3＞D1，故最佳提取工艺为 A3B2C2D2，即70%乙醇浓度，液料比20∶1，提取2次，提取时间90 min。

2.3.3 提取工艺验证 按照正交实验结果，取盐肤木药材5.0 g，加入20倍量70%乙醇，浸泡30 min，回流提取90 min，提取2次。平行提取3次，按照方法“2.2”项下测定盐肤木中总酚酸的含量，总酚酸含量结果分别为 3.57%、3.57%和 3.59%，RSD为0.32%，平均含量为3.58%，表明优选的提取工艺稳定可行。

3 讨 论

前期化学研究表明盐肤木酚酸类成分是其主要化学成分，主要包括鞣花酸、原儿茶醛、原儿茶酸、苔黑酚葡萄糖苷、对羟基苯甲酸等［11］，具有抗菌消炎、抑制细胞凋亡［14］、抗氧化［15］、神经保护［16-17］等活性，与盐肤木药材的“消肿、清热解毒、活血化瘀”作用相一致。因此盐肤木总酚酸部位是盐肤木的重要药效物质。

在盐肤木总酚酸醇提工艺研究过程中，考察了乙醇提取浓度、液料比、提取时间、提取次数等因素对总酚酸提取率的影响，并进一步采用正交设计优化最佳的提取工艺，最后确定盐肤木总酚酸的最佳提取工艺为乙醇提取浓度70%、液料比20∶1、提取时间90 min、提取次数2次。

本研究采用正交设计考察了盐肤木总酚酸的醇提工艺和大孔树脂法纯化工艺，为盐肤木总酚酸的产业化生产工艺提供参考，同时也为盐肤总酚酸部位的开发利用奠定基础。

致谢：本项目在福建省科技厅重点实验室、福建省中药资源研究与开发利用重点实验室完成。