桦褐孔菌多糖的优化提取及对小鼠高糖高脂诱导的非酒精性脂肪肝的影响

张蕾 郝婧玮 宛春雷

摘要：通过正交试验优化桦褐孔菌（Phaeoporus obliquus J. Schroet）多糖的提取，并作用于高糖高脂诱导的非酒精性脂肪肝小鼠，来探讨桦褐孔菌多糖对小鼠高糖高脂诱导的非酒精性脂肪肝病的作用效果。通过正交试验优化桦褐孔菌多糖的提取，将多糖作用于高糖高脂诱导的非酒精性脂肪肝小鼠，用ELISA方法检测小鼠血清中的相关指标。结果表明，与正常组比较，模型组小鼠肝脏明显增大，肝指数明显升高（P<0.01），与模型组比较，优化提取的不同浓度桦褐孔菌多糖提取物使小鼠肝脏指数明显下降，对肝脏有不同程度的改善，空腹血糖值下降明显（P<0.01），高浓度给药组（120 mg/kg）使小鼠血清中TC、LDL-C、HDL-C及ALT水平下降较明显（P<0.01），但TG水平变化不大。病理切片结果显示，桦褐孔菌多糖提取物给药组小鼠肝细胞破坏程度有明显改善，高浓度给药组小鼠肝细胞排列更紧密，中央静脉受累情况有明显改善，说明桦褐孔菌多糖提取物对高糖高脂诱导的小鼠非酒精性脂肪肝有一定的治疗效果，其机制可能是与降低血脂有关。

关键词：桦褐孔菌（Phaeoporus obliquus J. Schroet）;多糖;非酒精性脂肪肝;小鼠

中图分类号：R282.71;R965         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）14-0122-04

Abstract： To study the effects of Phaeoporus obliquus polysaccharose to non-alcoholic fatty liver disease in model mice induced by high-fat-high-fructose diet. Optimizing the extraction of Phaeoporus obliquus polysaccharose by orthogonal experiments， and the polysaccharide was used in mice with high sugar and fat-induced non-alcoholic fatty liver. Results showed that compared with normal group， model group mice liver increased obviously， and liver index increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the mice liver index significantly decreased by the extraction of polysaccharides of Phaeoporus obliquus. The livers had different degrees of improvement， and the fasting blood sugar levels decreased significantly（P<0.01）. The mice serum TC， LDL-C， HDL-C and ALT levels decreased significantly the in high dosage group （120 mg/kg）（P<0.01）， except TG. Pathological results showed that mice liver cell damage have significantly improved with Phaeoporus obliquus polysaccharose. The liver cells arranged closer， central vein situation has improved significantly in high dose group. Phaeoporus obliquus polysaccharose has therapeutic effect in non-alcoholic fatty liver disease in model mice， and its mechanism may be related to lower blood lipids.

Key words： Phaeoporus obliquus; polysaccharide; NAFLD; mice

樺褐孔菌（Phaeoporus obliquus J. Schroet），是一种生长在寒带的木腐菌，主要分布于北纬45°～50°地区，包括北欧、俄罗斯、日本及中国黑龙江和吉林等地区。其化学成分包括多糖类化合物、芳香物质、多酚类化合物、三萜类化合物等[1-4]。从16世纪以来，桦褐孔菌作为民间药物，在预防和治疗癌症、心脏病、肝病、降血糖、胃病等疾病方面功效独特且无明显的毒副作用[5，6]，但尚未见桦褐孔菌皂苷对非酒精性脂肪肝病的研究报道。本研究即通过优化提取桦褐孔菌多糖的提取物，将其作用于非酒精性脂肪肝病模型小鼠，通过检测小鼠血清生理生化指标及肝组织损伤程度来评价桦褐孔菌多糖提取物对非酒精性脂肪肝病的治疗效果，揭示其在防治脂肪肝方面的潜在价值。

1  材料与方法

1.1  试剂与仪器

桦褐孔菌购于黑龙江省绥芬河市;TG、TC、LDL、HDL、ALT试剂盒购于上海源叶生物科技有限公司;石蜡、乙醇购于北京化工厂;中性树胶购自上海凯博生物有限公司;HE染色液购自Solarbio公司。

CX31型电子显微成像系统（Olympus公司）;MT-360型静音混合器（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）;BT25S型电子天平（德国赛多利斯集团）;R20型旋转蒸发仪（BUCHI Switzerland公司）。

1.2  桦褐孔菌多糖测定

将桦褐孔菌粉末过筛，准确称取5 g粉末溶于30%的乙醇溶液中，分别改变提取条件为提取温度、提取时间、料液比以及超声功率，用80%的乙醇溶液沉淀多糖后，4 000 r/min离心7 min后取上清液，减压浓缩至浸膏后水浴至干，得粗制多糖，通过标准曲线的方法测定含量。

1.3  正交试验

在单因素试验基础上，以桦褐孔菌多糖提取率为考察指标，进行L9（34）正交试验，各因素与水平见表1。

1.4  小鼠造模

将40只雄性昆明小鼠适应性饲养7 d后随机分为正常组、模型组和药物低、高剂量组，每组10只，除正常组给予普通饲料外，其余各组均给予高糖高脂饲料造模，每天定点对小鼠进行灌胃，正常组和模型组小鼠灌胃等量的生理盐水，低剂量给药组给予60 mg/kg桦褐孔菌多糖进行灌胃，高剂量给药组给予120 mg/kg桦褐孔菌多糖进行灌胃，连续灌胃给药处理8周。

1.5  小鼠血糖、肝指数及生理生化指标的测定

每周测量小鼠空腹血糖及体重;处死小鼠前称重，处死后取下完整的肝脏用生理盐水清洗滤纸擦干后进行称重，并计算肝指数（肝指数=肝脏质量/体质量）;小鼠眼眶取血后静置10 min，3 000 r/min离心10 min取血清，然后按照试剂盒操作方法测定各组小鼠血清中ALT、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.6  肝组织HE染色

取肝脏组织，置于10%中性甲醛溶液中进行固定24 h，清洗后经梯度乙醇脱水，石蜡包埋后进行常规HE染色，通过倒置光学显微镜观察各组小鼠肝组织结构和肝细胞形态学变化。

2  结果与分析

2.1  多糖提取优化的结果

通过对比分析分别改变提取时间、超声功率、提取温度、料液比条件下桦褐孔菌多糖类物质的提取率。结果表明，提取时间30 min、超声功率40%，提取温度40 ℃、料液比1∶15时桦褐孔菌中的多糖提取量最大。通过正交试验确定桦褐孔菌多糖的最佳提取工艺。正交试验结果表明，影响桦褐孔菌多糖类物质提取量的因素主次顺序为B>A>D>C，超声功率和超声时間对桦褐孔菌多糖提取效果影响相对较大，即最佳的超声功率和超声温度时桦褐孔菌的多糖提取量最大，达到显著水平（P<0.05），其次为提取温度、料液比。综合以上条件，桦褐孔菌多糖的最佳提取条件为A2B3C3D3，即按1∶20的料液比在温度50 ℃下提取30 min，超声功率为60%，乙醇浓度为30%进行多糖含量测定（表2）。

2.2  桦褐孔菌多糖对小鼠肝指数的影响

小鼠灌胃给药8周后，与模型组比较，不同浓度的桦褐孔菌多糖提取物对小鼠肝脏有不同程度的改善，其中高剂量给药组肝脏指数明显降低，达到60.31 mg/g，低剂量给药组的肝脏指数为69.72 mg/g（图1）。

2.3  桦褐孔菌多糖对小鼠血糖的影响

小鼠基础水平下血糖浓度平均值为5.61 mmol/L，适应性饲养一周后开始造模，然后连续灌胃给药8周后，模型组的小鼠血糖浓度明显升高，达到8.17 mmol/L。通过桦褐孔菌多糖灌胃给药后小鼠血糖浓度与模型组相比较下降较明显，其中高剂量给药组小鼠血糖下降到6.93 mmol/L（P<0.01，N=10），低剂量给药组小鼠血糖下降到6.51 mmol/L（P<0.01，N=9），如图2所示。

2.4  小鼠血清中TC、TG、LDL、HDL及ALT水平检测

灌胃给药8周后，小鼠血清中TC、TG、LDL、HDL及ALT均有不同程度的改善。结果表明，与模型组相比，小鼠血清中的TG水平比正常组高，给药组小鼠血清中TG含量稍有降低，但并不显著;模型组小鼠血清中胆固醇水平为4.58 mmol/L，给药组小鼠血清中胆固醇水平明显下降（P<0.01），分别为2.16 mmol/L和3.32 mmol/L;与模型组相比，桦褐孔菌高浓度给药组小鼠血清中的LDL、HDL水平显著降低（P<0.01），分别下降到0.36 mmol/L和1.97 mmol/L，低剂量给药组下降到0.75 mmol/L和2.52 mmol/L;与模型组相比，桦褐孔菌不同浓度给药组小鼠血清中ALT水平下降明显（P<0.01）（表3）。

2.5  桦褐孔菌多糖提取物对模型小鼠形态学影响

正常组小鼠肝细胞排列紧密形状规则，肝索围绕中央静脉呈放射状紧密排列;模型组小鼠肝组织出现了明显的肝组织病变，肝细胞破坏严重，细胞肿大，排列紊乱，肝小叶中央受累更明显;低浓度和高浓度桦褐孔菌给药组小鼠肝细胞破坏程度有明显改善，高浓度给药组小鼠肝细胞排列更紧密，中央静脉受累情况有明显改善（图3）。

3  讨论

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是指虽无过量饮酒史但类似于酒精性脂肪肝的肝脏组织学病变的一种严重危害人类健康的慢性疾病。目前，中国NAFLD的发病率为15%左右，并呈现逐年上升的趋势，已经成为一种严重危害人类健康的世界性疾病，但其发病机制尚不清楚[7]。

本研究通过高糖高脂饲料喂养小鼠制备NAFLD模型，该模型在发病机制上与人类的NAFLD最相似，长期的高脂饮食可导致严重的肝功能损害。TG、TC、LDL-C、HDL-C是医学上常用的血脂方面的检测指标，血清中TG、TC的升高可导致体内血脂方面的代谢异常。LDL-C则能够损害血管内皮，是导致动脉粥样硬化、冠心病甚至心肌梗死等心脑血管疾病的重要危险因子，而 HDL-C能够协助转运胆固醇、促进其代谢为胆汁酸而表现出对机体的保护作用[8-11]，本研究结果显示，给药组小鼠血清中空腹血糖、TC、LDL-C、HDL-C水平明显低于模型组，说明桦褐孔菌多糖提取物对NAFLD模型小鼠有一定的治疗效果，但血清中TG水平变化并不明显，说明桦褐孔菌多糖提取物可能是通过降低小鼠的胆固醇水平来发挥降脂作用，这与张丽静[12]的芍药苷对小鼠高脂引起的非酒精性脂肪肝研究结果相似。ALT主要分布在肝脏的肝细胞内，肝细胞坏死时ALT就会升高，其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指标。

参考文献：

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