2型糖尿病患者FNDC5基因多态性与颈动脉粥样硬化相关性研究

潘娟 陈霞

1延安市人民医院老年病科 716000； 2延安市人民医院内分泌科 716000

颈动脉粥样硬化(CAS)已成为2型糖尿病(T2DM)患者最常见的致残、致死原因之一。Irisin是近年来新发现的肌肉因子，由含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5(FNDC5)经剪切修饰产生，可显著增加肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性，与糖尿病的发生和发展密切相关，机体irisin表达水平异常可能是T2DM患者发生微血管和大血管并发症的重要机制之一[1-4]。研究发现，FNDC5基因存在多个单核苷酸多态性(SNP)位点与机体irisin表达水平相关，且与多种疾病临床易感性相关[5-7]。本研究拟通过比较对照组和T2DM患者，以及有、无CAS的T2DM患者之间FNDC5基因rs16835198、rs3480和rs1570569位点基因型和等位基因分布频率的差异，探讨FNDC5基因多态性与T2DM及CAS的相关性，为临床提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年1月至2018年7月在延安市人民医院老年病科住院治疗的T2DM患者。入组标准：年龄18～80岁；T2DM诊断符合2013年中华医学会糖尿病学分会指定的《中国T2DM防治指南》[8]，且糖尿病病程>5年；临床资料完整。排除标准： 1型糖尿病患者；合并严重肝、肾疾病、恶性肿瘤、内分泌系统疾病、血液系统疾病、风湿免疫系统疾病、感染性疾病等疾病；妊娠期女性。本研究纳入T2DM患者共358例，包括男211例，女147例，平均年龄(55.7±9.6)岁。另外，随机选择同期在延安市人民医院体检的200名非糖尿病且经颈动脉超声检查正常的健康体检者作为对照组，其中包括男115名，女85名，平均年龄(56.5±8.3)岁。 本研究通过延安市人民医院伦理委员会审核批准，所有入组成员均充分知情同意。

1.2 方法

1.2.1 颈动脉超声检查 患者取仰卧位，应用Aplio 500彩色多普勒超声仪(日本东芝公司)检测颈总动脉分叉处，及分叉处远端和近端各1～1.5 cm处的颈动脉内膜中层厚度(CIMT)值，取左右两侧CIMT最大值作分析用。参考2010年中国高血压防治指南，将CIMT≥1 mm或颈动脉斑块形成诊断为CAS，并以此将T2DM组患者分为无CAS组和CAS组。

1.2.2 基因多态性检测 (1)基因组DNA提取：采集清晨空腹外周静脉血3 ml，采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全血基因组DNA。(2)SNP选择：根据Hapmap计划数据库中国汉族人群基因型数据结果，按照r2≥0.8，最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>0.05的标准，选取rs16835198、rs3480和rs1570569 3个标签SNP位点，可覆盖FNDC5基因全部MAF>0.05的常见SNP。(3)PCR扩增：上、下游引物均由上海生工生物技术有限公司合成，严格按照PCR操作流程进行。(4)纯化和延伸：采用Shrimp碱性磷酸酶去除PCR反应体系中剩余的dNTP和引物等进行纯化；然后加入延伸引物(表1)，进行单碱基延伸反应。(5)测序：采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法，使用MassARRAY Analyzer Compact仪器进行基因型检测。

1.2.3 其他参数采集 收集所有入组患者相关临床资料，主要包括患者性别、年龄、体重指数、糖尿病病程、收缩压、舒张压以及空腹血糖、HbA1c、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)等。

表1 PCR引物序列

注：SNP：单核苷酸多态性

2 结果

2.1 各组一般临床指标比较 与对照组相比，T2DM组CIMT、舒张压、空腹血糖、HbA1c、甘油三酯、总胆固醇和LDL-C水平均显著升高(P均<0.05)；年龄、性别、体重指数、收缩压和HDL-C差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

与无CAS组相比，CAS组CIMT、糖尿病病程、HbA1c、甘油三酯和总胆固醇水平均显著升高(P均<0.05)；年龄、性别、体重指数、收缩压、舒张压、空腹血糖、LDL-C和HDL-C差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表3。

2.2 各组rs16835198、rs3480和rs1570569位点基因型和等位基因分布比较 与对照组相比，T2DM组rs16835198、rs3480和rs1570569位点基因型和等位基因分布频率差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表4。

与无CAS组相比，CAS组rs16835198位点GG基因型和G等位基因以及rs1570569位点T等位基因分布频率均显著升高(P均<0.05)。rs3480位点基因型和等位基因分布频率差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表5。

2.3 T2DM患者发生CAS的危险因素分析 在T2DM患者中，以是否发生CAS为因变量，以年龄、性别、糖尿病病程、HbA1c、甘油三酯、总胆固醇以及rs16835198位点G等位基因和rs1570569位点T等位基因等为自变量，采用logistic多因素回归分析，结果显示，糖尿病病程和rs16835198位点G等位基因是T2DM患者发生CAS的危险因素，见表6。

3 讨论

Irisin是2012年由Spiegelman首次发现的肌肉因子，可改善糖、脂代谢，降低体质量，提高胰岛素敏感性，阻止肥胖和T2DM的发生。近年来，越来越多研究证据表明，irisin可能还参与T2DM患者靶器官损害过程[4]。研究发现，T2DM患者血清irisin水平显著下降，合并糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变的患者irisin水平下降更明显[6,9]。李白洁等[10]研究显示，在T2DM患者中，血清irisin水平与CIMT呈负相关。上述研究结果提示，irisin水平异常可能参与T2DM患者微血管和大血管动脉粥样硬化的病理改变过程。目前相关基础研究发现，irisin参与T2DM患者动脉粥样硬化的可能机制在于： irisin可通过激活蛋白激酶-磷脂酰肌醇3激酶-丝/苏氨酸蛋白激酶-内皮型一氧化氮合酶信号通路，降低高血糖对血管内皮细胞的损伤；抑制炎性因子mRNA表达，缓解炎性反应，阻止动脉粥样硬化进程；促进基质金属蛋白酶表达，促进血管再生，减轻糖尿病的血管损伤[4,11]。

表2 对照组和T2DM组一般临床指标比较

注：T2DM组：2型糖尿病组；CIMT：颈动脉内膜中层厚度；LDL-C：低密度脂蛋白-胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-胆固醇；1 mmHg=0.133 kPa

表3 无CAS组和CAS组一般临床指标比较

注：无CAS组：无颈动脉粥样硬化组；CAS组：颈动脉粥样硬化组；CIMT：颈动脉内膜中层膜厚度；LDL-C：低密度脂蛋白-胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-胆固醇；1 mmHg=0.133 kPa

表4 对照组和T2DM组rs16835198、rs3480和rs1570569位点基因型和等位基因分布比较[n(%)]

注：SNP：单核苷酸多态性；T2DM：2型糖尿病

表5 无CAS组和CAS组rs16835198、rs3480和rs1570569位点基因型和等位基因分布比较[n(%)]

注：SNP：单核苷酸多态性；无CAS组：无颈动脉粥样硬化组；CAS组：颈动脉粥样硬化组

FNDC5作为irisin的前体物质，其表达水平和活性状态与机体irisin水平密切相关。近年来，大量研究结果显示，FNDC5基因存在多个SNP位点，具有明确的生物学效应。Staiger等[12]发现，FNDC5基因rs16835198位点和rs726344位点基因多态性和机体胰岛素敏感性密切相关。Tanisawa等[13]以日本人群为研究对象，发现rs16835198位点基因多态性与空腹血糖和糖化血红蛋白有关。汪晶华等[6]在糖尿病肾病患者中发现，rs16835198位点基因多态性与病变严重程度相关。本研究选取rs16835198、rs3480和rs1570569 3个标签SNP位点，比较T2DM患者和对照组，以及有或无CAS的T2DM患者之间各位点基因型和等位基因分布频率差异。结果显示，各位点基因多态性与T2DM发病无明显相关性，但CAS组和无CAS组相比，两组rs16835198位点基因型和等位基因分布频率存在显著差异，rs1570569位点等位基因分布频率存在显著差异。进一步行logistic多因素分析结果显示，携带FNDC5基因rs16835198位点G等位基因可增加T2DM患者CAS的发生风险。

综上所述，本研究发现FNDC5基因rs16835198多态性与T2DM患者发生CAS密切相关。当然，本研究也存在诸多不足之处：首先，本研究为单中心小样本研究，得到的结果可能与真实世界存在偏差；其次，irisin蛋白作为最终产物，本研究限于条件，缺乏对其表达水平的检测，FNDC5基因多态性具体如何影响irisin的表达缺少证据支持；最后，由FNDC5基因到irisin蛋白涉及的过程复杂，调控因素众多，单个SNP位点如何发挥生物学效应，及各位点如何相互影响，尚不明确，期待后续进一步深入研究。

表6 T2DM患者发生CAS的危险因素分析

注：T2DM：2型糖尿病；CAS：颈动脉粥样硬化