响应面优化超声辅助VC/H2O2山楂果胶改性研究

朱毅伟,陈晓雯,赵立伟,朱传合*

响应面优化超声辅助VC/H2O2山楂果胶改性研究

朱毅伟1,陈晓雯1,赵立伟2,朱传合1*

1. 山东农业大学食品科学和工程学院, 山东 泰安 271018 2. 江苏派乐滋食品有限公司, 江苏 徐州 221000

果胶是一种酸性多糖，被广泛应用于食品行业及其它行业。果胶的生物活性与其分子量和结构密切相关。本研究以实验室自制山楂果胶为原料，采用超声辅助VC/H2O2改性山楂果胶，以固有粘度和还原糖含量为指标，采用单因素实验和响应面实验进行改性工艺优化。结果表明，最佳工艺参数为：H2O2浓度66 mmol/L、VC浓度21 mmol/L、温度30 ℃、超声次数207次、超声振幅31%，在此条件下，果胶的还原糖含量为52.22±0.68%，与预测值基本一致，说明该模型具有可靠性。

山楂果胶; 改性; 超声辅助VC/H2O2

果胶是一种存在于植物初生细胞壁和胞间层的大分子多糖[1]，因其具有凝胶、增稠、乳化等功能性质被广泛应用于食品行业，另外，果胶还可以用于保健食品和药品[2]。山楂中的果胶含量达6.4%，居所有水果之首[3]。研究显示，山楂果胶及其寡糖具有抑制光氧化损伤、抗氧化、抑菌等作用[4-6]。

果胶的生物活性与其分子量密切相关，在一定的分子量范围内，分子量越低，果胶的生物活性越高[7,8]。实验室前期制备得到的山楂果胶其分子量大、粘度高、水溶性差，限制了其生物活性的发挥。因此，选择适宜的改性方法可以降低果胶的分子量、改善其水溶性，从而具有更好的生物活性[9]。然而，改性果胶的研究主要集中在柑橘果胶方面[2,9]，对山楂果胶改性方面的研究报道较少。目前，果胶改性的方法主要包括酸/碱法、氧化法、酶法和超声等物理改性法[10]。在改性过程中，可以将多种改性方法联合使用，如超声辅助VC/H2O2改性，H2O2在酸性环境中，可以产生高活性的羟自由基（·OH），促进多糖氧化降解，另外，Fe2+、VC等可以作为催化剂，提高反应速率[11]。超声波对VC/H2O2改性具有协同作用，其空化效应能够引起果胶多糖等大分子物质的化学键断裂、自由基氧化等反应[12]，可以提高反应速率，降低反应时间以及H2O2用量。因此，本研究在单因素实验的基础上，设计响应面实验，优化超声辅助VC/H2O2改性山楂果胶的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂果胶（实验室自提）；VC、30% H2O2、亚硫酸氢钠、DNS、氯化钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PB153-S分析天平，METTLER TOLEDO；HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；TDZ5-WS台式低速离心机，湘仪离心机仪器有限公司；N-1300旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；ALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥机，德国CHRIST。

1.3 实验方法

1.3.1超声辅助VC/H2O2改性山楂果胶的工艺优化向山楂果胶中加入一定量的H2O2和VC，用去离子水定容，配成浓度为0.5%的山楂果胶溶液，取10 mL果胶溶液进行超声处理，超声波频率为20 kHz，探头直径6 mm，探头没入液面下1 cm，脉冲时间为3 s，间隔5 s。温度为30 ℃，改变超声次数（脉冲次数）和超声振幅。加入NaHSO3溶液（0.2 mol/L）终止反应，离心，浓缩，冻干，备用。

1.3.1.1 H2O2浓度对果胶固有粘度和还原糖含量的影响在温度30 ℃、VC浓度10 mmol/L、超声次数100次、超声振幅30%的条件下，研究H2O2浓度0、20、40、60、80、100 mmol/L对果胶固有粘度和还原糖含量的影响。

1.3.1.2 VC浓度对果胶固有粘度和还原糖含量的影响在温度30 ℃、H2O2浓度60 mmol/L、超声次数100次、超声振幅30%、VC浓度0、5、10、15、20、25 mmol/L的条件下处理果胶，测定其固有粘度和还原糖含量。

1.3.1.3 超声次数对果胶固有粘度和还原糖含量的影响在温度30 ℃、H2O2浓度60 mmol/L、VC浓度20 mmol/L、超声振幅30%、超声次数10、20、40、100、200、300次的条件下，以果胶固有粘度和还原糖含量为评价指标，确定最佳条件。

1.3.1.4 超声振幅对果胶固有粘度和还原糖含量的影响在H2O2浓度60 mmol/L、VC浓度20 mmol/L、温度30 ℃、超声次数200次的条件下，研究超声振幅0、20、30、40、50%对果胶固有粘度和还原糖含量的影响。

1.3.1.5 响应面优化在单因素实验结果的基础上，以还原糖含量作为评价指标，选取H2O2浓度、VC浓度、超声次数和超声振幅四个因素设计Box-Behnken实验，其因子编码及水平见表1。

表1 BB实验因素水平表

1.3.2 山楂果胶固有粘度的测定在室温条件下，使用奥氏粘度计测定固有粘度（[]）。将果胶溶解于0.1mol/L NaCl溶液中，配置成浓度为0.1 mg/mL的果胶溶液。取10 mL果胶溶液于粘度计中并记录溶液流经上下刻度的时间（t）。用0.1mol/L NaCl溶液代替样品溶液，重复上述操作，记录时间（0）。固有粘度的计算公式如下[13]：

式中，t和0分别为样品溶液和0.1 mol/L NaCl溶液流经上下刻度的时间；为样品溶液的浓度；η和η分别为增比粘度和相对粘度。

1.3.3山楂果胶还原糖含量的测定还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法进行测定[14]。以D-Gal A为标准品，绘制标准曲线，方程为=1.4051-0.1176（2=0.9990）。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 H2O2浓度对果胶固有粘度和还原糖含量的影响由图1可知，随着H2O2浓度的增加，固有粘度显著降低（<0.05），在60 mmol/L后趋于平稳；还原糖含量随着H2O2浓度的增加呈先上升后下降的趋势，在60 mmol/L时还原糖含量最高。高浓度的H2O2反而会抑制果胶的降解，因此，选择H2O2浓度为60 mmol/L进行响应面实验。

图 1 H2O2浓度对果胶固有粘度和还原糖含量的影响

Fig.1 Effect of H2O2concentration on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.2 VC浓度对果胶固有粘度和还原糖含量的影响图2表明随着VC浓度的增加，固有粘度显著降低（<0.05），在VC浓度达到10 mmol/L后对固有粘度的影响不显著（˃0.05）；还原糖含量随着VC浓度的增加而增加（<0.05），在VC浓度为20 mmol/L时达到最大，综合考虑两个指标，确定VC浓度为20 mmol/L。

图2 VC浓度对果胶固有粘度和还原糖含量的影响

Fig.2 Effect of VC concentration on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.3 超声次数对果胶固有粘度和还原糖含量的影响通过图3可知，随着超声次数的增加，固有粘度显著降低（<0.05），在超声次数达到100次后趋于平稳；还原糖含量随着超声次数的增加而增加（<0.05），在超声次数为200次后变化不显著（˃0.05），分析原因可能是由于加入样品中的H2O2和VC浓度有限，在达到一定超声次数后，继续增加超声次数并没有改变产生的自由基数量，所以反应效果也逐渐趋于平稳。综合考虑固有粘度和还原糖含量，选择超声次数为200次进行后续实验。

图3 超声次数对果胶固有粘度和还原糖含量的影响

Fig.3 Effect of ultrasonic timeson intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.1.4 超声振幅对果胶固有粘度和还原糖含量的影响由图4可以看出，随着超声振幅的增加，固有粘度显著降低（<0.05），在超声振幅为30%后趋于平稳；还原糖含量在超声振幅30%时最高，继续提高超声振幅，还原糖含量略有降低（˃0.05）。可以看出，超声对反应体系具有催化作用，能够显著提高反应速率。考虑能耗等方面，选择超声振幅为30%进行响应面实验。

图4 超声振幅对果胶固有粘度和还原糖含量的影响

Fig.4 Effect of ultrasonic amplitude on intrinsic viscosity and reducing sugar content of pectin

2.2 响应面优化

根据单因素实验结果，设计BB实验，用自变量A、B、C、D表示H2O2浓度（mmol/L）、VC浓度（mmol/L）、超声次数（次）、超声振幅（%）四个因素，以还原糖含量为响应值（Y）。利用软件Design Expert8.0.6对实验结果进行分析，得到回归模型参数和方差分析，结果见表2和表3。

表2 BB实验设计及结果

表3 回归模型的方差分析

Table 3 Variance analysis of regression model

以还原糖含量为响应值，建立二次响应面模型，拟合得方程为：

（还原糖含量）=52.68+0.68+3.72-0.11+0.17+1.34-1.27+1.23-0.012+2.94-0.17-2.172-8.102-3.362-6.522。

根据表2可知，响应面回归模型极显著（<0.0001），失拟项不显著（=0.4753>0.05），相关系数（2）为99.71 %，表明该回归模型拟合度较高，在各因素的研究范围内可以较好地预测实际值。此外，较低的变异系数（C.V.=0.93）也说明了回归模型的可靠性高，误差较小。根据值和值可知，各因素对还原糖含量的影响大小依次为：VC浓度>H2O2浓度>超声振幅>超声次数。其中，VC浓度和H2O2浓度对还原糖含量的影响显著（<0.001），而超声振幅和超声次数对还原糖含量的影响不显著（>0.05）；二次项、、、、2、2、2和2影响显著（<0.001）。

将回归模型中的任意两个因素固定在零水平，获得其余两个因素相互作用对还原糖含量的影响，其响应面图如图5所示。

图5 响应曲面图

Fig.5 Response surface plots

从图5a和图5f中响应面的陡峭程度可以看出，H2O2浓度和VC浓度对还原糖含量的影响显著，从图5b和图5d可以看出，VC浓度对还原糖含量的影响要大于H2O2浓度。同样的，从图5c和图5e可以得到类似的结果。通过比较图5b和图5c（或图5d和图5e）可知，超声振幅比超声次数对还原糖含量的影响大。

2.3 验证实验

根据回归模型得到最佳改性条件为：温度30 ℃、H2O2浓度65.73 mmol/L、VC浓度21.36 mmol/L、超声次数206.67次、超声振幅31.01%，在此条件下，预测还原糖含量为53.29%。根据实验的可操作性，将实验条件设定为：温度30 ℃、H2O2浓度66 mmol/L、VC浓度21 mmol/L、超声次数207次、超声振幅31%。在此条件下重复三次实验，还原糖含量为52.22±0.68%，与预测值（53.29%）偏差不大（>0.05）。这表明该模型是可靠的。

3 结 论

本实验在单因素实验的基础上，通过Box-Behnken实验优化了山楂果胶的改性工艺。由响应面分析结果可知各因素对还原糖含量的影响大小依次为：VC浓度>H2O2浓度>超声振幅>超声次数，其中VC浓度和H2O2浓度对还原糖含量的影响显著。综合回归模型和验证实验，最终确定超声辅助VC/H2O2改性山楂果胶的最佳条件为：H2O2浓度66 mmol/L、VC浓度21 mmol/L、温度30 ℃、超声次数207次、超声振幅31%，在此条件下进行三次平行验证实验，实际测得还原糖含量的平均值为52.22±0.68%，与理论预测值基本一致（>0.05），说明回归模型的可靠性高。研究表明超声辅助VC/H2O2改性山楂果胶是一种切实可行的方法，能够降解果胶，实现果胶高效修饰。

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115-119,114

Study on the Hawthorn Pectin Modified by which Response Surface Optimized Ultrasonic with VC/H2O2

ZHU Yi-wei1, CHEN Xiao-wen1, ZHAO Li-wei2, ZHU Chuan-he1*

1.271018,2.221000,

Pectin is an acidic polysaccharide, which is widely used in food industry and other industrial fields. The biological activity of pectin is closely related to its molecular weight and structure. Using the hawthorn pectin in the laboratory as raw material, we adopted ultrasound-assisted VC/H2O2to modify hawthorn pectin, and optimized the modification process by single factor experiment and response surface experiment with the inherent viscosity and reducing sugar content as indicators. The results show that the best process parameters were: H2O2concentration 66 mmol/L, VC concentration 21 mmol/L, temperature 30 °C, pulse number 207 and ultrasonic amplitude 31%. Under these conditions, the reducing sugar content of pectin was 52.22±0.68%, which was basically consistent with the predicted value. It shows that the model has reliability.

Hawthorn pectin; modification; ultrasonic with VC/H2O2

TS201.7

A

1000-2324(2019)04-0686-06

2019-04-04

2019-04-21

山东省2017年度农业重大应用技术创新项目;山东省重点研发计划(GG201703080015);山东省“双一流”奖补资金资助(SYT2017XTTD04);泰安市大学生科技创新行动计划

朱毅伟(1998-),女,在校本科生,专业方向:食品质量与安全(中英). E-mail:1260193690@qq.com

Author for correspondence. E-mail:chhzhu@sdau.edu.cn