食物过敏原检测技术研究进展

王雅清,倪皓洁,李华韬,潘 童,杨仁迪,傅玲琳,王彦波

(浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江食品质量安全工程研究院,浙江杭州 310018)

食物过敏已成为全球共同关注的焦点问题,它能引起急性或慢性疾病,危害人类健康。研究显示,成人的食物过敏率约为5%,而儿童的食物过敏率接近于8%,并且数据表明,发病人数和死亡人数均呈上升趋势[1]。目前,国内外开发了多种食物过敏原检测技术,常见的有酶联免疫吸附技术、免疫印迹技术、质谱技术、生物传感器技术等,这些检测技术对于食物过敏的预防和控制具有重要的现实意义,取得了显著的应用效果。鉴于此,本文结合国内外食物过敏原检测技术研究现状,分别从蛋白质与核酸两个角度阐述食物过敏原检测技术优缺点,旨在为食物过敏引起的食品安全提供技术依托,最终保障消费者的健康。

1 基于蛋白质的食物过敏原检测技术

1.1 免疫检测技术

研究表明,食物过敏原在食物中含量极少,多以蛋白质为主。免疫检测技术是目前检测食物中过敏原蛋白的重要手段(表1),其工作原理基于抗原抗体发生的特异性结合,其中包括免疫吸附技术、免疫印迹技术、生物传感器技术等。

表1 近三年食物过敏原免疫学检测技术相关研究概述Table 1 Summary of studies on food allergen detection by immunology in recent three years

1.1.1 免疫吸附技术 在食物过敏原检测方面,酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)应用最为广泛。该法是基于酶标记抗体与抗原或特异性蛋白结合,并通过显色反应程度进行定性定量检测。实践证明ELISA技术操作简便,试剂方便易得,标准化自动化程度高,目前ELISA试剂盒也已成为一种商业化的产品。

常用的ELISA技术主要有竞争ELISA技术和夹心ELISA技术两种,均具有特异性高、敏感性强、实用性强等优点。Segura-Gil等[2]建立了间接竞争ELISA和夹心ELISA方法用于检测加工食品中的大豆过敏原,检测限分别为0.19、0.06 μg/g,夹心ELISA方法灵敏度优于竞争ELISA方法。此外,夹心ELISA可检测添加0.05%大豆饮料的UHT牛奶样品和添加0.005%大豆种子的饼干中的大豆过敏原,回收率为87.2%～119.3%,变异系数低于7.2%,表现出良好的稳定性和再现性。研究发现,ELISA检测的灵敏度与选用抗体的性质有关,选用亲和力高的单克隆抗体有助于提高检测灵敏度。Kiyota等[3]开发了一种基于单克隆抗体的ELISA检测橙子及其加工食品中的主要过敏原Cit s 2的方法,定量范围为2.5～40.0 ng/mL,变异系数低于10%,回收率为107%～132%,表明该方法具有高灵敏性和高重现性。Jeong等[4]利用基于重组Fag e 3产生的单克隆抗体建立双位点ELISA法,定量检测荞麦提取物中的过敏原天然Fag e 3,实验表明该单克隆抗体对天然Fag e 3具有良好的亲和力,检测限为0.8 μg/g。

在传统ELISA基础上还发展出了荧光酶联免疫分析技术(Fluorometric enzyme immunoassay,FEIA)。基于荧光酶联免疫分析原理建立的ImmunoCAP®系统已获得国际临床实验室标准委员会的确认,被公认是体外诊断过敏性疾病的标准[5],它能准确量化特异性IgE。周艳君等[6]采用ImmunoCAP系统检测荞麦sIgE水平,结合免疫印迹结果推测荞麦过敏原的重要致敏蛋白,为研究荞麦致敏蛋白组分奠定基础。

除具备操作简单易标准化、特异性高、灵敏度高等优点外,ELISA技术仍具有一定的局限性。部分商业化的ELISA试剂盒难以准确检测痕量蛋白[7]。另外,受食物基质、实验操作、交叉反应等因素影响易出现假阳性结果。目前国内外关于ELISA技术检测食物中多种过敏原的文献较少,该技术仍主要用于检测食物中单一过敏原组分。

1.1.2 免疫印迹技术 免疫印迹技术(Immunoblotting test,IBT),又称为蛋白质印迹技术(Western blotting),综合了高分辨率凝胶电泳与固相免疫分析,分析容量大、敏感度高、特异性强,但分析时间较长。该法是先利用凝胶电泳将样品中抗原蛋白分离并转移固定化基质膜上,再通过放射物质或者酶标记的抗体对膜进行检测和分析。

免疫印迹技术广泛应用于食物过敏原的鉴定与半定量分析。Babu等[8]利用聚丙烯凝胶电泳将茄子果皮浓缩物中的蛋白分离,通过免疫印迹法鉴定茄子中的多种过敏原,并首次将植物多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)鉴定为茄子中重要的过敏原。Satoh等[9]利用米糠过敏患者的血浆进行免疫印迹分析,研究了水稻谷粒中水稻过敏原的分布,并鉴定米糠过敏的潜在致病过敏原是52 kDa的球蛋白,为加强水稻产品中过敏原的控制,提高过敏症诊断提供依据。近年来,双向免疫印迹法与质谱联用的组合已经成为鉴定各种食物中潜在过敏原的有力工具。Lu等[10]对四名大豆过敏患者的血清和六名大豆致敏患者的血浆进行双向免疫印迹分析,结合四极杆-飞行时间串联质谱(QTOF-MS/MS)分析结果鉴定大豆主要的过敏原是β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。De Silva等[11]用25名蛋白过敏患者的血清进行免疫印迹分析,证实大多数蛋白过敏患者具有针对蛋黄蛋白的特异性IgE,结合质谱提高了检测灵敏度和准确性,结果显示,VTG-1、VTG-2和Apo B的成熟蛋白片段具有显著的IgE结合能力,证实了Gal d 6(YGP42)是蛋黄的重要过敏原。

1.1.3 生物传感器技术 生物传感器技术是近几年研究的热点,具有检测快速性、高灵敏度、微型化、低成本等优点[12]。检测食物过敏原最常用的是免疫传感器,它将分子识别元件与样品发生特异性反应产生的物理、化学信号转化为可以检测的光、电信号。根据测定原理可分为表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)传感器、场效应(Field effect transistor,FET)生物传感器、电化学免疫传感器等。

近几年,SPR传感器因其优越的检测性能成为目前的一个研究热点,并已成功应用于食物过敏原检测领域。例如Ashley等[13]开发了一种基于免疫分析的SPR传感器,可直接检测食品制造商的原位清洗系统(Clean in place,CIP)最终冲洗样品中牛奶过敏原,检测限为0.578 μg/g,灵敏度可达亚ppm级。该方法简单、无需标记,检测限低于市售的ELISA试剂盒(检测限为2.5 μg/g)。具有最佳澄清性能的蛋制品可作为酿酒加工助剂,用于澄清或精制葡萄酒,但任何残留在葡萄酒中的蛋清蛋白都可能对过敏的消费者构成风险。Pilolli等[14]先结合聚乙烯基聚吡咯烷酮纯化和尺寸排阻色谱对样品进行预处理,优化后建立了一种基于SPR传感器的快速检测方法来量化葡萄酒中的鸡蛋过敏原,检测限低至0.2 μg/g,实验证明生物传感器是监测葡萄酒残留污染水平的有效工具。

研究影响传感器性能的因素也尤为重要,Hideshima等[15]开发了一种FET传感器检测荞麦过敏原,并通过引入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)来实现FET传感器检测信号放大。利用SDS与样品偶联,检测效果提高,成功检测出荞麦中含量很低的过敏原蛋白,与靶蛋白偶联的最佳SDS浓度为1%(w/w)。纳米材料因其特异性、灵敏性、快速性等优点逐渐被引入生物传感器,可提高装置检测性能。Jiang等[16]成功将异硫氰酸荧光素融合在二氧化硅壳包覆的Fe3O4纳米粒子的二氧化硅层内,开发了一种基于阳离子荧光纳米磁珠的新型电化学大鼠嗜碱性白血病细胞传感器,可用于检测虾过敏原蛋白和鱼过敏原蛋白,检测限分别为0.03 μg/g和0.16 ng/g。Alves等[17]采用基于金纳米颗粒改性的丝网印刷碳电极的双单克隆抗体夹心型电化学免疫传感器检测花生过敏原,检测限低至3.8 ng/g。

目前,生物传感器因其快速性、微型化等优点逐渐应用于过敏原检测,并具有较好的检测灵敏度。由于对样品预处理的高要求,一定程度上限制了生物传感器简便的应用与商业化的可能性[12]。研制新型的纳米材料并将其应用于生物传感器,实现样品的快速优化处理,得到更好的性能,是目前研究的趋势。

1.2 质谱检测技术

质谱技术(Mass spectrometry,MS)同样发展迅速,已成为检测食物过敏原的新趋势(表2),应用时多与高效分离纯化技术如液相色谱(Liquid chromatography,LC)、毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)等相结合,具备了灵敏度高、准确性好、分离与鉴定同时进行等优点。

表2 近三年食物过敏原质谱检测技术相关研究概述Table 2 Summary of studies on food allergen detection by mass spectrometry in recent three years

液相色谱-质谱联用法在鉴定过敏原蛋白及其亚型方面具有重要意义,Yu等[19]结合模拟胃液(Simulated gastric fluid,SGF)消解,采用基于质谱的蛋白质组学技术和序列同源性分析,高效鉴定了大黄鱼中两种潜在的过敏原——β-烯醇酸和原肌球蛋白α-1链,与已知的来自其他物种的蛋白质过敏原具有高度的序列相似性。该方法为高通量筛选潜在的过敏原提供了一个有效方案,在鱼类过敏原控制方面具有广阔的应用前景。Chen等[20]采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(UPLC-QTOF-MS)法快速检测复合食品中的虾过敏原蛋白-原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)和精氨酸激酶(Arginine kinase,AK),检测限分别为8、5 g/kg。在分析基于UniProt数据库的肽质量指纹图谱的基础上,筛选出了两个特异性热稳定肽作为标记肽,分别为TM的AsNaEGEVAALNR和AK的VSSTLSSLeLelk。

质谱法在复杂食品中过敏原的识别方面受到越来越多的关注,能同时对多种过敏原蛋白进行高通量的检测,弥补了ELISA技术的不足。坚果和花生是常见的过敏原,并且坚果类过敏现象随儿童年龄增长而消失的可能性较小,Sealey-Voyksner等[21]利用液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(LC-QTOF-MS/MS)识别了坚果的特异性肽组,建立可在一次分析中筛选和定量检测11种坚果过敏原和花生的方法,灵敏度可达到亚ppm级,特异性强。该研究的关键点在于找到合适的标记肽。质谱法对样品要求较高,处理费时,针对这一问题,Pilolli等[22]对样品采用基于超声波辅助溶剂萃取和快速尺寸排阻色谱的两步处理法,结合固相萃取(Solid-phase extraction,SPE)与反相液相串联质谱(LC-MS/MS),建立了一种快速、灵敏的质谱选择反应监测方法(LC-SRM),有效简化了分析工作流程。该方法可对人工污染的无过敏原饼干基质中的五种过敏原(鸡蛋、牛奶、大豆、榛子和花生)同时进行分析,所分析的过敏原均能得到较低的检测限。

质谱技术在食物过敏原蛋白组学分析中发挥越来越重要的作用,且在检测复杂基质及加工食品中的多种过敏原具有优越性。选择合适的样品预处理方式和稳定的特征肽段,有助于提高质谱检测的灵敏度与准确性,可为改善食物过敏现状提供一定的技术支持。

2 基于核酸的食物过敏原检测技术

基于蛋白质的检测方法虽然直接,但是易受食品基质的影响,造成检测误差。基于核酸的检测方法是间接检测分析,检测过敏原蛋白或其他基因的DNA,目前主要用于一些含量很低或者成分复杂食品中过敏原的检测(表3)。

表3 近三年基于核酸的食物过敏原检测相关研究概述Table 3 Summary of studies on food allergen detection based on nucleic acid in recent three years

2.1 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reation,PCR)是一种在体外模拟体内DNA复制的核酸扩增技术,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。由于其简便易行、灵敏度高等特点,已逐渐成为一种标准化的检测方法。Eischeid等[24]采用实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测复杂食物基质中甲壳类贝类过敏原。Fernandes等[25]做了类似研究,利用同种技术检测作为潜在过敏原的虾甲壳类动物,检测限为1 mg/kg。两者均证实了qRT-PCR可以准确检测和量化食品中的甲壳类过敏原。前者试验对螃蟹具有特异性,成功地检测出掺入复杂食品基质中的几种螃蟹。后者试验针对甲壳类动物设计了靶向16S rRNA基因的通用引物,可以准确检测和量化食品中的虾。传统的PCR技术以定性检测为主,而qRT-PCR技术实现了从定性到定量检测的飞跃。Pierboni等[26]首次报道了数字聚合酶链反应(Digital PCR,dPCR)用于检测食品中过敏原的评估,提出dPCR是一种适用于检测食品中花生和大豆过敏原的新技术,除了具有Real-time PCR的优势外,还能够识别非特异性靶标,如Gly m 5-MGB,可以降低对抑制剂的敏感性,节省时间和成本。

2.2 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一门新兴的基因扩增技术,由Notomi等人在2000年首次报道[27]。其采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行核酸扩增[28]。因其操作简单、产物易检测,反应时间短,故LAMP在食品微生物检测、转基因成分检测、过敏原成分检测等方面被广泛应用。Garrido-Maestu等[29]在比较qPCR和实时环介导等温扩增(Real-time loop-mediated isothermal amplification,qLAMP)检测面筋效果的研究中,发现两种方法都适用于谷蛋白谷物,但qPCR更敏感。这是第一项描述基于qLAMP检测谷蛋白的特定方法的研究,尽管qLAMP方法不适合种子,但仍为其余样品提供了最快的结果。Sheu等[30]开发了一种用于检测花生的高特异性LAMP引物,其检测限比PCR更敏感,证实LAMP技术可以鉴定生花生和含有花生的商业食品。

Kim等[31]开发了直接双重环介导等温扩增(Direct Duplex real-time loop-mediated isothermal amplification)测定法用于同时检测牛奶和山羊奶,在30 min内可以检测到在山羊奶中高达2%的牛奶含量,亦可在同一时间范围内检测到在牛奶中高达2%的山牛奶含量。虽然双重LAMP检测的灵敏度比单重LAMP检测低10倍,但是当比较10 pg的奶牛和1 pg的山羊时,其灵敏度显示更高或相同。因此可以确定该技术的灵敏度足以在单一反应中同时检测两种目标物质。该测定无需DNA提取,适合于快速现场检测,可同时监测商业牛奶和酸奶产品中牛和山羊DNA的存在,防止牛奶和牛奶产品中的欺诈性物种标记。

与传统变温核酸扩增技术相比,LAMP技术无需昂贵的实验室设备,如热循环仪,其反应结果可直接通过肉眼观察是否具有白色焦磷酸镁沉淀从而进行判断,或通过添加羟基酚蓝、钙黄绿素等荧光染料实现显色观察[32],适于快速检测和现场检测,在食品检测领域具有广阔的应用前景。

3 食物过敏原检测技术优缺点对比

食物过敏原的检测方法虽多,但仍然有不同的特征。酶联免疫吸附技术运用较广泛,其特异性强和灵敏度高尤为显著,但容易因发生交叉反应而出现假阳性结果。免疫印迹技术因其操作快速简单且高效而广泛使用,但分析时间很长且易受影响。生物传感器技术因微型化、高灵敏度、检测快速的特点而受到关注且大量研究,逐渐应用于实际检测,但仪器制备的高要求使此方法还未被广泛应用。质谱技术兼具高灵敏度和准确度,可检测多重过敏原但样品的处理对结果影响很大。聚合酶链式反应技术不仅灵敏度高、特异性强,同时适合定量分析复杂食品过敏原,但是该方法对操作者的要求很高,对于同一批的样品提取的核酸会经常出现假阳性和污染现象。环介导等温扩增技术较PCR方法灵敏度高了2～5个数量级且操作简单,但在引物设计上要求很高,样品易形成气溶胶污染。

4 结论与展望

近年来,食物过敏现象在全球范围内广泛出现,备受各国政府的高度关注。许多国家致力于分析食物过敏原蛋白并完善标志食物过敏原制度,迫切需要不断发展快速、高效的食物过敏原检测技术。根据表4可知,每种检测方法兼具其优势与局限性。目前,ELISA是食品工业中过敏原检测和定量的最常用方法之一,检测方便快捷。部分商业化的ELISA试剂盒被广泛使用,并被认为是检测许多常见食物过敏原的可靠方法,但仍存在不能准确检测痕量蛋白、易发生交叉反应得到假阳性结果的局限性。结合新技术开发高特异性、高精密度、高准确度的试剂盒是目前的研究趋势。与ELISA相比,PCR技术可以通过优化引物等来克服交叉反应的影响。然而传统的PCR技术是直接测定过敏原蛋白基因,无法证实食物真正的过敏性,容易出现假阳性结果,且操作过程较为繁琐,时间较长,对于仪器设备具有较高的要求,不能够在临床快速检测中使用。目前,我国已经具有基于环介导等温扩增技术的食品检测标准。该技术具有较强的特异性和较高的灵敏度,不需要昂贵仪器,能够实现单一样品多种靶基因的同时检测。LAMP技术还可以通过多种LAMP设计、与芯片技术结合等手段进一步完善及优化,从而实现灵敏、特异、快速及高通量的目的,可被广泛应用到卫生防疫、食品安全检测等领域,具有广阔的前景。质谱技术因能检测多重过敏原和能与其他高性能技术联合的特性受到食品工业的青睐。但质谱技术存在操作耗时、仪器昂贵、成本高等缺点,使其无法满足市场商业化的需求。生物传感器技术被认为是传统免疫测定方法的有效的替代方法,可实现同时检测多种食物过敏原,检测快速、灵敏度高、成本低、可微型化,具有广阔的应用前景。由于对样品的高要求,样品预处理相对复杂,一定程度上限制生物传感器商业流通化。结合新型纳米技术等,实现样本处理的快速简便化,建立可商业化的生物传感器,使真正发挥生物传感器技术的潜在优势。

表4 食物过敏原检测技术比较[1,35]Table 4 Comparison of food allergen detection technology[1,35]

总之,随着科学技术的不断进步,多种学科交叉的检测技术也不断涌现。质谱、生物传感器等技术的应用,为检测深加工食品中痕量过敏原或复杂过敏原做出了贡献。开发高效高通量、快速经济的多种食物过敏原检测技术是目前的大方向。新兴检测技术不断出现,传统检测技术突破创新,将多种检测技术联合优化应用于食物过敏原检测,推动我国食品安全的发展,进而保障人民的健康生活。