牡丹油体提取及其稳定性研究

李婷婷 李志远 孙 静 陶 俊 赵大球

(扬州大学园艺与植物保护学院，扬州 225009)

油体是由单层磷脂膜包裹液态的三酰甘油(TAG)组合而成，它是植物中储存油脂的一种亚细胞结构[1]，且存在于几乎所有积累油的植物组织中。油体密度相较于其它细胞结构最小，因而能够浮于水溶液表层，易于分离[2]，其可为种子的萌发和幼苗的早期生长发育提供能量，也可临时存储同化产物参与碳源的分配[3]。因其类似于天然脂质的作用，油体在食品、药物和工业产品等行业中应用广泛，其乳化剂的性质也使得油体在疫苗、化妆品和个人护理产品等方面具有一定的应用[4]。此外，在油体中表达具有较高营养功效的外源蛋白或多肽还可以提高种子的营养成分、改善种子的食用品质、增加植物的附加值[5]。目前，关于植物种子中油体提取的研究已有相关报道。例如，采用水提法可以从大豆中提取稳定的油体[6]；采用Tris-HCl法提取出来的亚麻芥种子油体大小均一且稳定[7]；杨晶等[8]采用PBS作为提取缓冲液，通过去除蛋白质可以得到更加纯净的红花油体；玉米胚芽采用水萃取提取油体并在初始提取液中应用超滤技术可防止油体聚结，从而提高油体提取率并保持其自然完整性[9]。由此可见，不同植物提取种子中油体的适宜方法并不相同，因此研究不同植物的油体提取方法十分必要。

牡丹是我国的传统名花，它不仅具有较高的观赏和药用价值，还是近些年新兴的木本油料作物。牡丹种子富含脂肪酸，其中α-亚麻酸因为人体必备的脂肪酸而备受人们的关注[10]。

目前，关于牡丹籽油的研究主要集中于籽油的提取工艺和精炼技术[10]、脂肪酸成分及理化特性[11]、牡丹籽油的功效[12]等方面。油体作为植物储存脂质的亚细胞器颗粒，它的正常发育是脂肪酸储存和积累的前提[13]，相反，脂肪酸的含量与组成也影响着油体的化学与物理性质[14]。油桐油体与脂肪酸的研究就表明其脂肪酸含量与油体发育关系密切[15]。关于牡丹脂肪酸的储存，尤其是油体方面的研究一直鲜见报道。本研究采用分级法[16]和优化法[17]对牡丹油体进行提取与比较，在获得相对较好提取方法的基础之上，对所提取油体在不同温度、pH、NaCl浓度、糖浓度等条件下的稳定性进行研究，从而对牡丹油体的性质进行了解，便于充分利用牡丹籽油中各类脂肪酸的功能、特性，挖掘牡丹油体在不同领域的应用需求价值。

1 材料与方法

1.1 材料

以栽植于扬州大学牡丹芍药种质资源圃中的‘凤丹’为材料，采集花后120天的‘凤丹’种子用于油体的提取。

1.2 主要仪器与设备

5810R高速台式冷冻离心机；IX83荧光显微镜；CFX96荧光定量PCR仪；60D数码相机。

1.3 方法

1.3.1 油体的提取

分别采用分级法[16]和优化法[17]提取牡丹种子中的油体。

分级法：称取大小适中、色泽一致的种子5 g浸泡5 h后用解剖针除去种皮种胚，在种子中加入20 mL研磨液(0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸钠缓冲液)并于4 ℃冰上研磨成匀浆离心，在上层加入20 mL漂浮液Ⅰ(0.4 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸钠缓冲液)，离心后取上层油层加入20 mL去污清洗液(0.1% Tween-20 0.2 mol/L蔗糖，5 mmol/L pH=7.5的磷酸钠缓冲液)再次离心，在所得上层中加入20 mL磷酸钠缓液，离心并收集上层油层于离心管中，加入离子洗脱液(2 mol/L氯化钠，0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸钠缓冲液)20 mL后于上层加入漂浮液Ⅱ(2 mol/L氯化钠，0.25 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH= 7.5的磷酸钠缓冲液)20 mL后离心。收集油层重悬于20 mL尿素，室温震荡后加入20 mL 磷酸钠缓冲液，离心后收集油层于研磨液中加入己烷混匀，再次离心后去掉上层己烷油层重悬于20 mL研磨液，上层加入20 mL漂浮液离心，最终收集油层于10 mL离心管中备用。

优化法：取新鲜种子5 g，加6倍去离子水胶体磨均，过滤取出上清液4 ℃，10 000 r/min离心30 min。取上浮物溶于5倍加入0.5 mol/L NaCl和0.4 mol/L蔗糖的pH=7.0的Tris-HCl 0.05 mol/L溶液中搅拌过胶体磨20 min后离心。取上浮物加入5倍去离子水，再加入0.1% tween20充分混合，静置后离心。取上浮物加入2倍己烷混匀后离心，上层油体分离冷藏4 ℃备用。

1.3.2 油体提取方法的比较分析

对采用上述方法提取的油体外观、提取率、显微结构、4 ℃条件下储存两周的稳定性和油体蛋白组成进行观察和检测，从而筛选出相对较好的提取方法。

油体提取率=提取油体的质量/种子的质量×100%

油体显微结构的观察:取少量油体，加蒸馏水稀释后滴在载玻片上，盖好盖玻片，放置在荧光显微镜(IX83，奥林巴斯株式会社)下采用40倍物镜观察其显微结构并拍照。

油体在4 ℃下储存两周的稳定性比较:将利用两种方法提取出的牡丹油体均放入4 ℃的冰箱中储存，两周后取出，将其置于玻片中并观察、比较其显微结构。

油体蛋白SDS-PAGE检测:取两种方法提取出的牡丹油体样品各20 μL于EP管内，向其中加入20 μL去离子水后再加入10 μL的5 × Loading buffer，混合均匀后于沸水中煮10 min，制备12%的SDS-PAGE液。蛋白样品经上样缓冲液处理后在每孔中加样10 μL，用12%分离胶进行SDS-PAGE电泳分离，每块胶的初始电流强度为20 mA，10 min后改为60 mA，当样品达到胶板底部时结束电泳，用考马斯亮蓝G250染色2 h后脱色拍照观察。

1.3.3 油体的稳定性研究

取新提取的油体2 mL，分别进行不同温度和pH值条件下的处理。将量取的油体部分置于50、70、90 ℃的水浴锅内水浴加热30 min，另一部分置于用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调节的pH值为5.0、7.0、9.0、11.0的样品中，处理结束后观察其显微结构。

取新提取的油体20 mL，分别用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)和去离子水(pH=7.0)1∶5稀释混匀，取前者稀释过的溶液10 mL依次加入50、100、150、200 mmol/L的NaCl，取后者稀释后的溶液10 mL以25、50、70、100 mmol/L梯度的糖浓度制备油体悬浮液，后观察其显微结构。

2 结果与分析

2.1 油体提取方法的比较

2.1.1 油体外观和提取率

从外观上看，两种方法提取的油体均呈透明状态，差异不大。但从提取率上来看，分级法提取油体的提取率仅为10.25%，比优化法的提取率低了12.38%。

2.1.2 油体显微结构及其在4 ℃储存2周后的稳定性

通过对油体的显微结构观察可以发现，两种方法提取的油体在提取初期都是大小均一、分散均匀、杂质较少、密度大；但将油体在4 ℃储存2周后，分级法提取的油体出现了大幅度的聚合和皱缩，而优化法提取的油体除少部分粒径增大外仍然能够保持相对较好的稳定性(图1)。

注：a为分级法提取油体的显微结构；b为分级法提取油体在4 ℃储存2周后的显微结构;c为优化法提取油体的显微结构；d为优化法提取油体在4 ℃储存2周后的显微结构。图1 油体的显微结构及其在4 ℃储存2周后的稳定性

2.1.3 油体的SDS-PAGE电泳检测

对两种方法提取的油体进行SDS-PAGE电泳检测，发现2种提取方法对油体中所含的蛋白质种类没有影响，但与分级法相比，优化法提取油体的条带颜色显著较深(图2)。

注：M为蛋白marker；1为分级法；2为优化法。图2 两种方法提取油体的SDS-PAGE电泳检测

通过对上述油体相关指标的综合比较，可以发现优化法提取的牡丹油体相对较好，下面将采用优化法提取油体进行稳定性研究。

2.2 油体的稳定性研究

2.2.1 不同温度对油体稳定性的影响

图3为50、70、90 ℃条件下的牡丹油体，通过观察可以发现，随着温度的升高，油体出现了不同程度地破裂，但总体上油体依然分散均匀、密度大，杂质也较少、大小均一。

图3 不同温度条件下油体的稳定性

2.2.2 不同pH对油体稳定性的影响

由图4可知，当pH值为5.0和7.0 时，显微镜下的油体粒径相比pH值为9.0和11.0时要明显增大，油体有显著聚集现象，形状不规则均一，甚至存在部分破裂，稳定性显著下降；当pH值为9.0和11.0时，油体粒径基本不变，显微镜下仅有少数油体聚集，油体较稳定。

图4 不同pH条件下油体的稳定性

2.2.3 不同NaCl浓度对油体稳定性的影响

由图5可知，牡丹油体的结构及粒径随着NaCl浓度的变化而发生改变。当NaCl浓度为50 mmol/L时，相较于图2中未经NaCl处理的牡丹油体，其显微结构没有发生明显地变化。当NaCl浓度在100～200 mmol/L时，牡丹油体的粒径随着浓度的增加而变大，油体也逐渐开始聚集和破裂，当NaCl浓度增加到200 mmol/L时，牡丹油体已经大面积的破裂和聚集，油体大小不均一，杂质极多，稳定性显著降低。

图5 不同NaCl浓度条件下油体的稳定性

2.2.4 不同糖浓度对油体稳定性的影响

图6显示牡丹油体的稳定性与糖浓度关系密切。当糖浓度为25 mmol/L时，牡丹油体的结构和粒径没有发生明显地变化，当糖浓度为50 mmol/L时，牡丹油体开始出现小部分的破裂，油体粒径变大，大小不太均一，当浓度增加到70～100 mmol/L时，牡丹油体大面积破裂和聚集的现象显著，相较于未处理过的油体，100 mmol/L糖浓度的牡丹油体中出现了超大油体，大小极不均一，杂质极多，稳定性显著下降。

图6 不同糖浓度条件下油体的稳定性

3 讨论

本研究采用分级法和优化法对牡丹种子中油体进行提取，随后对油体的外观、提取率、显微结构、4 ℃储存两周后稳定性和油体蛋白组成等指标进行比较，最终确定了优化法更加适合牡丹油体的提取。单从外观来看，两种方法提取的油体均呈透明状态，差异不大，但分级法提取的油体透明度更高，这可能是由于其在提取过程中的多步的清洗所致。而就提取率而言，优化法的提取率更高，达到22.63%，这主要是由于优化法步骤简单使得油体提取损耗大大降低，而分级法的多步清洗导致油体提取的回收损耗增加。在SDS-PAGE电泳检测油体蛋白的结果中，优化法提取油体的条带颜色较深，这可能是由于分级法操作中在去除杂蛋白的同时也对油体蛋白产生了一定的影响，因此优化法提取的油体蛋白含量要高于分级法，这也可能是优化法的油体提取率要高于分级法的原因。此外，在4 ℃储存两周后经显微观察可知，分级法提取的油体出现了大幅度的聚合和皱缩，而优化法提取的油体依旧大小均一、分布均匀，具有较好的稳定性。

油体的稳定性是由其表面的油体蛋白决定的，油体表面存在电荷，当离油体蛋白等电点较近时，油体表面的静电荷接近于零，油体之间会因静电聚合作用而发生聚集，从而导致油体粒径增大，形状不规则；反之油体不发生聚集，具有较好的稳定性[7]。而油体的稳定性容易受到外界环境的影响，例如温度、pH值、NaCl和糖浓度等[18]。本研究的结果显示，温度对于牡丹油体的影响不大，在50、70、90 ℃条件下，油体均能保持相对稳定，这与花生油体稳定性的研究结果相一致[19]。有研究推测，油体上的油体蛋白与TAG形成“发卡结构”[20]，在外界温度条件升高时，油体蛋白的头部伸入到TAG内部而免受破坏，因此油体在温度变化的条件下依旧能保持较好的稳定性。高红桃等[7]关于亚麻芥种子油体的稳定性研究表明，油体本身带负电荷，以偏碱性的条件处理会使静电荷量增加，油体之间因斥力较大而能保持平衡且不发生聚集，相反，在酸性及中性条件下，油体之间因斥力小而容易出现聚集甚至破裂的现象，使其粒径变大。本研究也证实了pH的变化对牡丹油体的稳定性有一定的影响。当pH≥9.0时，牡丹油体稳定分布；pH≤7.0时牡丹油体稳定性被破坏，尤其是当pH为5.0时，油体粒径显著增大；7.0

本研究通过比较确定了优化法为适合牡丹油体提取的方法，并从温度、pH值、NaCl和糖浓度等几个因素其研究油体的稳定性，通过对牡丹油体性质的研究，充分了解和利用牡丹籽油中各类脂肪酸的功能、特性，挖掘牡丹油体在食品、药品、化妆品和个人护理产品等不同领域的应用需求价值。

4 结论

通过对两种牡丹油体提取方法的比较研究，得出优化法更适宜于牡丹油体的提取。在牡丹油体的稳定性研究中，温度、pH值、NaCl和糖浓度对其影响不一，即：温度对牡丹油体的稳定性影响不大，牡丹油体在中性和酸性条件下(pH≤7.0)稳定性容易受到破坏，牡丹油体在低浓度的NaCl(50 mmol/L)和糖(25 mmol/L)条件下能够表现稳定。