红茶菌在绿茶液中培养条件优化

马燕 黄海珠 金桩 易永红 陈俊波 谢式云

摘要：该研究将分离筛选所得的酵母菌、产膜醋酸菌和短杆乳酸菌复配得到红茶菌，以绿茶基液为发酵液，对红茶菌中3株菌接种量、配比、时间、温度、加糖量和装液量培养条件进行优化。结合pH值、菌膜生成情况及菌液总活菌数，得出最佳接种比例分别为酵母菌1%、产膜醋酸菌3%、乳酸菌1%，即总接种量5%，最适培养温度为30°C，最佳培养时间为8d，绿茶基液最适加糖量8%，装液量60%。

关键词：红茶菌;优化;pH值;菌膜;总活菌数

中图分类号：TS275

文献标识码：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.22.001

0引言

红茶菌是以茶叶、糖和水为发酵基液，由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多种有益微生物所组成的共生体共同发酵而成[1-2]。红茶菌虽在我国民间流传已久，但对红茶菌菌种及其相互作用方面的基础研究还不够系统[3]，在红茶菌菌种培养过程中，由于红茶菌来源不同，筛选纯化的单一菌种复合配伍后的培养条件及培养基液成分构成等都有待进一步探讨[4-6]。本研究主要将分离筛选得到酵母菌、产膜醋酸菌和短杆乳酸菌进行复配培养得到共生体，通过将绿茶液中的培养条件优化，得到优质的红茶菌，为下一步生产中草药红茶菌制剂提供红茶菌母种，并用于猪场防控疫病及提高不同猪群的生产性能。

1材料与方法

1.1菌种来源

由罗牛山股份有限公司博士后科研工作站实验室，从不同来源（山东威海及广东湛江）购买的红茶菌产品中分离筛选得到的优势微生物酵母菌、产膜醋酸菌和短杆乳酸菌作为试验菌种。

1.2仪器设备

生化培养箱（LRH-150上海一恒科学仪器有限公司）;pH计（FE28梅特勒一多利仪器（上海）有限公司）;3M菌落总数测试片（6406明尼苏达矿业制造（上海）国际贸易有限公司）;电热鼓风干燥箱（101A-2B型上海实验仪器有限公司）;生物洁净工作台（SA-960-2型，上海上净净化设备有限公司）;电子天平（BL6100北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.3测定方法

pH值测定：采用PH酸度计直接测定;

总活菌数测定：采用3M试纸计数;

菌膜：观察膜光滑程度，采用游标卡尺测量菌膜厚度。

1.4菌种培养

酵母菌培养基：葡萄糖20g，酵母菌提取物10g，蛋白胨20g，硫酸镁0.5g和磷酸二氢钾0.3g，琼脂20g，1L蒸馏水。加热使所有成分溶解，冷却后用6mol/L的H°CL将pH值调至4.2，分装，121°C湿热灭菌20min，斜面接种，30°C培养24h，置冰箱中保藏备用。扩大培养采用液体培养基（上述培养基不加琼脂），接种30°C培养41h，酵母菌数量在108°Cfu/mL以上，置冰箱中冷藏备用。

产膜醋酸菌培养基：葡萄糖20g，酵母浸膏3g，蛋白胨2g，碳酸钙10g，琼脂20g，pH值6.8，蒸馏水1000mL，划平板接种，30°C培养3d，置冰箱冷藏备用。扩大培养采用液体培养基（上述培养基不加碳酸钙和琼脂），灭菌后冷却至50°C左右加入无水乙醇2%，接种30°C培养7d，其培养菌液pH值达到3.0以下，总活菌数达到104°Cfu/mL以上，置冰箱中冷藏备用。

短杆乳酸菌培养基[7]：蛋白胨12g，酵母提取物5g，牛肉膏12g，葡萄糖16g，乙酸钠5g，柠檬酸胺2.15g，吐温80mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.03g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，水1000mL，pH值5.5。摆斜面接种，温度为35°C培养24h，置冰箱冷藏备用。扩大培养采用液体培养（上述培养基不加琼脂），培养条件相同，分光光度计测定其菌液OD值增加0.9以上，菌数达到1010cfu/mL以上，冰箱保藏备用。

1.5培养条件优化试验

培养条件优化：制备绿茶发酵基液正交筛选红茶菌三株菌最适复配比优化培养红茶菌时间、温度、加糖量和装液量等条件。

1.6试验数据统计

用WPS电子表格对试验数据进行统计分析和图表处理。

2结果与分析

2.1制备绿茶发酵基液

绿茶液发酵基液制备：蔗糖（白砂糖）5%，绿茶和水比例为1：150，将水煮沸，在100°C水中加入蔗糖及茶叶煮沸5min再浸提20min，过滤茶渣，自然pH值，按40%的装液量分装备用[8-10]。

2.2筛选红茶菌各菌种接种量最适复合配比

试验采用L9（34）正交试验，以红茶菌产品中分离筛选得到的3株菌（按酵母菌、产膜醋酸菌、短杆乳酸菌顺序）液体活化菌种为3个因素，分别按1%、2%、3%为3个水平接种量组合接种到绿茶液培养基中，在温度为30°C条件下静置培养10d，通过pH降低变化值（△pH值）筛选最适红茶菌各菌种接种量复合配比组合。试验设计见表1，结果见表2。

红茶菌各菌种接种量实际最优复合配比组合为AIB3C3即酵母菌1%，产膜醋酸菌3%，短杆乳酸菌3%，10dpH值降低2.69。但经分析得出理论最优组合为AjB3C，与实際操作组合不一致，通过验证试验结果表明：理论组合A.B3C10d△pH值为2.91，比实际组合pH值多下降0.22。赵文红4等通过正交试验研究菌种比例对绿茶发酵液品质的影响，接人酵母菌、醋酸菌和乳酸菌量最优组合为3%、1%、3%。左勇中等将分离筛选得到的乳酸菌、醋酸菌和酵母菌进行配比得到红茶菌复合菌种，结果表明，乳酸菌、醋酸菌、酵母菌按质量配比2：2：1，即总接种量5%，在传统培养基中发酵效果最好。马骋[5]等采用自行分离纯化的酵母菌Y1、乳酸菌R3、醋酸菌C5进行纯种混合发酵生产红茶菌饮料，结果表明，酵母菌：醋酸菌：乳酸菌的比例是1：1：2，接种量为5%红茶菌的发酵效果最好。红茶菌单一菌种复合配比虽各不同，但总接种量均为5%左右，本研究根据正交验证试验结果选用红茶菌单一菌种接种量最适复合配比为酵母菌1%，产膜醋酸菌3%，短杆乳酸菌1%，可见与上述研究均不同，这可能是菌株种类及菌种来源不同而有所差异的原因，但总接种量亦为5%，由正交试验结果显示，产膜醋酸菌对红茶菌生长影响最大，其次是酵母菌，而短杆乳酸菌影响最小。见表2。

2.3优化红茶菌复合菌种各培养条件

2.3.1培养时间

按最佳接种量组合接种至绿茶液培养基中，30°C静置培养，0、2、4、6、8、10、12d分别观察菌膜情况及取样测定pH值、总活菌数，以确定红茶菌最佳培养时间，见表3。

随着时间的延长，红茶菌在培养初期1～6d，pH值明显降低，培养6d后菌液表面形成成片菌膜;培养6～8dpH值趋于稳定，菌膜厚度逐渐增厚变光滑，第8d菌数达到峰值;8d后pH值变化不大，有新的菌膜生成但厚度增加不明显，菌液活菌数逐渐减少。廖卢燕等以研究红茶菌发酵液与菌膜中主要微生物的数量变化结果表明，通常红茶菌菌液中的醋酸菌和酵母菌数量都要比红茶菌菌膜中的数量多，培养初期酵母菌和醋酸菌的数量基本上都呈上升的趋势，发酵6～8d后数量不断慢慢下降。因此本实验选择红茶菌最佳培养时间为8d。见图1。

2.3.2培养温度

按最佳接种量组合接种红茶菌至绿茶液培养基中，分别在25、28、30、33、36°C温度条件下，培养8d，分别观察菌膜情况及取样测定pH值、活菌数，以确定最佳培养温度，见表4。

培养温度为28°C时，总活菌数最多，pH值也相对较低，但其菌膜并未成片生成，分析其原因是酵母菌和乳酸菌在培养前期生长均比较旺盛，菌液活菌数增多，而其中乳酸菌的大量繁殖使pH值降低，在一定程度上又抑制产膜醋酸菌生长，导致菌膜生成速度变慢;在30°C温度条件下培养，菌膜表面光滑厚度可达3.73mm，pH最低为2.74，总活菌数略少于28°C培养，说明在此温度下酵母菌大量繁殖其代谢产物促进了产膜醋酸菌生长，菌膜大量形成，将菌液中的部分活菌包埋及菌体自身形成菌膜导致菌液中的总菌数减少，随着菌膜厚度增厚，菌液环境更适合兼性厌氧菌短杆乳酸菌生长，菌液pH值降低明显;33°C和36°C2个温度条件下，红茶菌也可以生长，但通过观察测定菌膜、pH值及总活菌数3个指标比较均不如30°C培养好。综合3个测定指标，为了更有利于红茶菌互生互利生长，筛选红茶菌最佳的培养温度为30°C。见表4。

2.3.3加糖量

分别添加蔗糖（白砂糖）量为0%、2%、4%、8%、10%、12%配制绿茶液培养基，自然pH值，按40%装液量分装后接种最佳接种量组合菌种，温度30°C条件下培养8d，分别观察菌膜情况、pH值降低变化值（△pH值）及总活菌数，以确定最佳加糖量。见表5。

白砂糖的添加量小于10%时，随着加糖量不断增多，红茶菌复合菌菌液的pH值降低变化比较明显，当加糖量为8%时，菌膜表面光滑厚度达1.58mm，pH值降低变化值达到峰值，总活菌数最多。进一步增大加糖量达10%～12%，菌膜生成情况变差，其pH值降低程度与8%相差不大，总活菌数均低于8%的加糖量。试验结果说明蔗糖（白砂糖）添.加量适宜可以促进红茶菌生长繁殖，添加量过低则菌体不长或繁殖缓慢，过高反而会抑制生长，因此确定绿茶液中最适加糖量为8%。见表5。

2.3.4装液量的影响

在250mL三角瓶中分别装人绿茶液培養基的量为20%、40%、60%、80%，按最佳接种量组合接种至加糖量为8%的绿茶液培养基中，30°C条件下培养8d，分别观察菌膜情况、pH值降低变化值（△pH值）及菌数，以确定最佳装液量。见表6。

按不同装液量在250mL三角瓶中装入绿茶培养基培养红茶菌，当装液量为60%时，其菌膜表面光滑且厚度最厚，pH值的降低幅度最大，菌液中的总活菌数也最多，生长状况最佳，而装液量过少或者过多都影响菌膜生成及菌体生长。童婕好[11]等对夏秋茶发酵红茶菌的初步探究结果表明，以容量600mL计算，控制每瓶装液量为400mL，菌种平缓地进行发酵作用，可控性较高，因此在66.67%装液量条件下，最为适宜。乔宏萍[2]等研究不同发酵体积对红茶菌酸度、菌膜以及口味的影响结果发现，150mL盐水瓶中装不同体积的茶糖水进行发酵，在装液量为75mL时（即装液量50%），无论从酸度还是口感都不错，各项发酵指标达到平衡，酸度和口味达到最佳。但是发酵体积越小，也就是瓶中的空气量越多，菌膜越厚，发酵体积越大，菌膜越少，发酵时间越长。左勇[1等研究装液量对红茶菌发酵的影响结果表明，当装液量为40%时，菌体生长状况最佳，而装液量过多或过少，都不利于菌体生长。可能是因为装液量过少时，营养物含量低，不利于菌种的生长和酶的合成;装液量过多，环境含氧量低，不利于氧气的供给，也不利于菌体的生长繁殖和代谢。本研究最佳装液量为60%，在上述研究范围内。

3结论

（1）通过本研究所得结果分析，红茶菌复合菌种最佳接种酵母菌、产膜醋酸菌和乳酸菌的量分别为1%、3%、1%，即总接种量5%。

（2）优化红茶菌复合菌种在绿茶液中培养的最适条件：培养温度30°C，培养时间8d，最适加糖量为8%，装液量60%。

参考文献

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[2]乔宏萍，燕平梅，武晓英，等，红茶菌发酵条件的优化研究[J].生物技术世界，2016（1）：54-55.

[3]廖卢燕，蒋立文.红茶菌培养过程中菌相变化的初步研究[].中国食物与营养，2009（8）：23-26.

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[5]马骋，林娟，杨美容，等.“红茶菌”饮料发酵工艺条件的优化[J].食品研究与开发，2008（3）：36-38.

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