山豆根治疗白血病作用机制的网络药理学研究

付海荣 庞毅 谭家华 李晶 邓雪松

摘 要 目的：探討山豆根治疗白血病的潜在作用机制。方法：运用中药系统药理学分析平台数据库检索山豆根活性成分及其对应靶点蛋白，借助UniProt、PubMed数据库查询活性成分靶点蛋白对应的基因名称，运用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物-靶点网络。通过DisGeNET数据库查询与白血病相关的基因（即疾病靶点），借助OmicShare平台筛选山豆根活性成分靶点与白血病疾病靶点的交集基因，利用STRING数据库和Cytoscape 3.6.0软件构建其蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并进行拓扑学分析;利用DAVID生物信息学数据库进行基因本体（GO）分析和KEGG通路富集分析。结果：共获得山豆根活性成分13个、靶点蛋白204个，节点度值排名靠前的化合物及靶点蛋白包括槲皮素、山柰素以及前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、蛋白质丝氨酸蛋白酶1（PRSS1）、钙调蛋白依赖的蛋白激酶（CAMKK2）等。山豆根活性成分靶点与白血病疾病靶点的交集基因共24个，包括IRF1、BCL2、CYP1A1、PIM1等。上述交集基因的PPI网络共包含节点24个、边142条，平均节点度值为6.5，平均介数为0.045。GO分析结果显示，上述交集基因的生物过程涉及缺乏配体的体外凋亡信号通路、凋亡过程的负调控、B细胞增殖的正调控等，分子功能主要包括蛋白质同源化活性、相同蛋白质的结合等，细胞组分主要包括胞外区、线粒体等。KEGG通路富集分析结果显示，上述交集基因主要与T细胞受体信号通路、Janus激酶/信号传导及转录激活因子（JAK/STAT）信号通路、人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒（HTLV-Ⅰ）感染等通路有关。结论：山豆根中的活性成分可能通过JAK/STAT信号通路、HTLV-Ⅰ感染等通路作用于PTGS2、PRSS1、CAMKK2等靶点，进而发挥对白血病的治疗作用，呈现多成分、多靶点、多通路的特点。

关键词 山豆根;白血病;网络药理学;靶点;基因;通路

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate the potential mechanism of Sophora tonkinensis in the treatment of leukemia. METHODS： The active components and their target proteins of S. tonkinensis were searched by the analysis of traditional Chinese medicine system pharmacology platform， and UniProt database and PubMed database were used to query corresponding gene names of target proteins of active components. Cytoscape 3.6.0 software was used to construct compound-target network. The genes related to leukemia were searched by DisGeNET databases， and OmicShare platform was used to screen the intersection genes of the active component targets of S. tonkinensis and leukemia disease targets. STRING database and Cytoscape 3.6.0 software were used to construct PPI network， and topological analysis was performed. GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed by using DAVID bioinformatics database. RESULTS： There were 13 active components and 204 target proteins in S. tonkinensis. The components and targets with high node degree included quercetin， kaempferol， PTGS2， PRSS1， CAMKK2， etc. There were 24 intersection genes between the active component target and leukemia target， including IRF1， BCL2， CYP1A1， PIM1， etc. PPI network of the above intersection genes contained 24 nodes and 142 edges， with an average node degree of 6.5 and an average medium of 0.045. The results of GO analysis showed that the biological process of the above-mentioned genes involved in apoptosis signaling pathway in vitro without ligands， negative regulation of apoptosis process， positive regulation of B cell proliferation， etc. Molecule function mainly included that protein homology activity and binding of the same protein. Cell components mainly included extracellular region， mitochondria and so on. KEGG pathway enrichment showed that above-mentioned genes were mainly associated with T cell receptor signaling pathway， JAK/STAT signaling pathway， HTLV-Ⅰ infection. CONCLUSIONS： Through JAK/STAT signaling pathway and HTLV-Ⅰ infection pathway， the active components of S. tonkinensis may act on PTGS2， PRSS1， CAMKK2 and other targets， and then play a therapeutic role on leukemia， showing the characteristics of multi-component， multi-target and multi-channel.

KEYWORDS   Sophora tonkinensis; Leukemia; Network pharmacology; Target; Gene; Pathway

白血病（Leukemia）是造血系统最常见的恶性肿瘤，发病率和病死率均较高，其主要症状为贫血、发热、出血、疲乏、胸骨压痛以及肝、脾、淋巴结肿大、神经系统炎症、骨骼及关节病变等[1]。该病常见的病因包括病毒感染、化学因素、电离辐射、放射污染等，同时还与个体自身条件、遗传因素以及所处环境有关[2]。研究表明，我国白血病发病率占各类型肿瘤的第6位[3]，且位居儿童恶性肿瘤的首位，已成为儿童死亡的主要原因之一[4]。目前，临床上治疗白血病的方法主要包括造血干细胞移植、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法、化学药治疗等[5]。但由于上述治疗手段存在供体稀少或排斥反应明显、毒副作用大等潜在风险，严重影响了患者的疗效和预后[6-7]。因此，寻找高效、低毒的药物是治愈白血病的关键。

中药具有药源广、毒性低、靶点多等特点，在白血病治疗领域具有一定的研究价值[8]。祖国医学早在《皇帝内经》《金匿要略》等医籍中就有关于白血病临床表现及发病特点的记载，该症属中医学“虚劳”“热劳”“瘀积”“血证”范畴[9]。研究表明，多数医家对白血病辨证分型较为统一的观点为“本虚标实”，其中“本虚”主要以气阴、气血两虚为主，多由病程迁延、反复发作所致;而“标实”则包含“痰”“瘀”“毒”等3种，三者往往相互夹杂，尤其是痰凝、瘀血通常同时出现[10]。

山豆根为豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根及根茎，主产于我国广西西南部至西北部，具清热解毒、利咽消肿之功，常用于治疗咽炎、心律失常等症[11]。山豆根的主要成分包括生物碱、黄酮、三萜、多糖类等化合物，其中生物碱（氧化苦参碱、苦参碱等）是山豆根的主要活性成分和药效物质基础[12]。据报道，氧化苦参碱具有抗病毒、调节免疫、改善炎症、抗氧化等药理作用[13-14];苦参碱可通过诱导细胞凋亡和直接损伤细胞膜而杀伤鼠淋巴细胞白血病L1210细胞[15]，还可提高人急性淋巴细胞性白血病MOLT-4细胞的早期凋亡率，使得Bcl-2编码基因表達下降[16]。由此可见，山豆根及其活性成分具有一定的开发价值。

网络药理学突破了传统的“一种药物，一个靶点”理念，借助网络分析、生物信息技术等手段，对传统中药成分的潜在靶点、药理作用进行多基因、多靶点、多途径的系统研究，可系统地、整体地探究中医药的药理机制，为中医药现代化研究提供了新的思路[17]。网络药理学与中药研究的结合，有助于辨识活性成分、预测作用靶点、阐明作用机制和途径，并为挖掘新的活性化合物奠定了基础[18]。鉴于此，本研究采用网络药理学的方法对山豆根用于治疗白血病的可能作用机制进行了系统探讨，以期为白血病的药物治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 山豆根活性成分及靶点蛋白的筛选

运用中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“Shan Dou Gen”“Sophora tonkinensis Gagnep.”等为关键词查询山豆根所含化学成分。根据TCMSP推荐，以口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18（其中，OB是客观评价药物分子口服生物利用度的重要指标，DL是评价药物分子成药性高低的指标）[19]作为筛选条件，对山豆根活性成分及其对应靶点蛋白进行筛选。

1.2 化合物-靶点网络的构建

首先通过UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）、PubMed数据库（https：//www.ncbi.nlm.nib.gov/pubmed）查询活性成分靶点蛋白对应的基因名称，再利用Cytoscape 3.6.0软件构建山豆根化合物-靶点网络，并进行可视化展示和拓扑学分析。以节点表示活性成分和靶点蛋白，节点之间以边相连;节点度值表示与某节点相连边的数量，其值越大，表明该节点在网络中越重要（下同）。

1.3 交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的构建

为进一步了解山豆根靶点蛋白和白血病靶点在蛋白水平上的相互作用机制，先以“Leukemia”为关键词，通过DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/）查询与白血病相关的基因（即疾病靶点）;再将山豆根靶点蛋白对应基因和白血病靶点基因上传至OmicShare平台（http：//www.omocshare.com），选择“韦恩图”，获得山豆根活性成分靶点与白血病靶点的交集基因。将上述交集基因导入STRING数据库（http：//string-db.org/）中，构建山豆根与白血病的PPI网络，并以节点度值为指标，使用Cytoscape 3.6.0软件进行可视化展示和拓扑学分析。

1.4 交集基因的通路分析

将“1.3”项下所得交集基因导入DAVID生物信息学数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）中，进行基因本体（GO）分析和KEGG通路富集分析。在此过程中，限定物种为“Homo sapiens（人）”，标识符（Identifier）设置为“Official gene symbol（官方名称）”，以P值反映生物功能的显著性及通路的富集程度（P<0.05，表示该富集结果具有显著性;P值越小，则其显著性越高）。将P值由小到大排序前20位的富集结果导入Omishare在线作图平台（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）中进行可视化展示。

2 结果

2.1 山豆根活性成分的筛选结果

通过TCMSP共检索到山豆根化学成分79个;以OB≥30%和DL≥0.18为标准，共筛选出活性成分21个，其基本信息见表1（表中，两个“槐醇”的分子构象不同，故其TCMSP编号以及OB、DL均不同）。

2.2 化合物-靶点网络的分析结果

山豆根化合物-靶点网络见图1（图中，三角形表示山豆根活性成分，矩形表示靶点蛋白对应的基因）。由图1可见，该网络共包括217个节点和788条边，其中活性成分节点13个[表1中的醉茄素、槐树素、大豆皂苷be、槐醇（MOL003663、MOL003677）、大豆皂苷C、臭豆碱、槐胺碱等8个活性成分没有对应靶点]、靶点蛋白节点204个。该网络中，每个化合物平均与5.67个靶点互相作用，每个靶点平均与2.99个化合物相互作用。拓扑学分析结果显示，节点度值排序前5位的化合物分别为槲皮素、山柰素、芒柄花黄素、异鼠李素、黄羽扇豆魏特酮，分别能与154、63、39、37、21个靶点蛋白发生作用;节点度值排序前5位的靶点蛋白分别为前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、蛋白质丝氨酸蛋白酶1（PRSS1）、钙调蛋白依赖的蛋白激酶2（CAMKK2）、热休克蛋白90α家族B类成员1（HSP90AB1）、PTGS1，分别与9、8、8、8、6个化合物发生作用。

2.3 山豆根与白血病的交集基因

通過UniProt和PubMed数据库查询到山豆根活性成分靶点蛋白对应基因168个（排除非人类的靶点基因），在DisGeNET数据库中获得白血病相关基因1 916个。通过韦恩图（见图2）可知，山豆根活性成分靶点和白血病疾病靶点的交集基因共有24个，分别为IRF1、BCL2、CYP1A1、PIM1、MPO、ACHE、GSK3B、STAT1、IL10、PIK3CG、PLAT、SOD1、IL2、IFNG、IL4、TOP2A、ICAM1、RB1、ODC1、F3、CDKN2A、JUN、CYP1B1、TOP1。

2.4 山豆根与白血病PPI网络的分析结果

将上述筛选出的24个交集基因导入STRING进行PPI分析，其可视化图谱见图3。由图3可见，该网络共包含节点24个、边142条，平均节点度值为6.5，平均介数为0.045。

2.5 交集基因通路的分析结果

将上述交集基因导入DAVID生物信息学数据库中进行GO分析，共得到GO条目29个（P<0.05），其中生物过程18个、分子功能7个、细胞组分4个，主要涉及缺乏配体的体外凋亡信号通路、蛋白质同源化活性等，且主要集中在胞外区，详见表2～表4。

KEGG通路富集分析共筛选出46条信号通路（P<0.05），主要涉及T细胞受体信号通路、Janus激酶/信号传导及转录激活因子（JAK/STAT）信号通路、人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒（HTLV-Ⅰ）感染等，详见图4（图中数字为P值）。

3 讨论

山豆根收载于2015年版《中国药典》（一部）中，为豆科植物越南槐（S. tonkinensis Gagnep.）的干燥根及根茎[20]。该药为常用中药材，味苦，性寒，具有清火、解毒、消肿、止痛等功效，可用于治疗心律失常、黄疸、咽喉炎等疾病[1，21-22]。近年国内外研究表明，山豆根具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保护心血管系统、增强免疫力、抗炎、抗溃疡等多种活性[23]。药理研究证明，山豆根生物碱具有抗菌、消炎、平喘、抗癌和保肝等活性[24];部分黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用[25];同时，山豆根的总糖含量为54.37%，且具有抗氧化、增强免疫力的活性[26]。

本研究通过TCMSP共检索到山豆根活性成分21个，其中有对应靶点的成分13个。由山豆根化合物-靶点网络可见，上述13个活性成分作用于204个靶点，充分体现了中药治疗疾病多成分、多靶点的特点。张良等[27]研究证明，复方山豆根注射液对B16黑色素瘤和Lewis肝癌荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长均具有抑制作用，并可延长小鼠的生存期。姚仲青等[28]研究发现，山豆根总生物碱对S180、H22、ESC肿瘤细胞具有一定的抑制作用，但抑瘤率偏低。该网络中，节点度值排序前5位的化合物依次为槲皮素、山柰素、芒柄花黄素、异鼠李素、黄羽扇豆魏特酮，其中槲皮素的相关研究较多。槲皮素能全面地作用于肿瘤的启动、促进和发展等3个阶段，兼有抗促癌、抗致癌和诱导分化的作用，对人白血病细胞、乳腺癌细胞等均有一定的抑制作用[29];同时，该化合物还可促进宫颈癌HeLa细胞的凋亡、抑制人乳腺癌T47D细胞的增殖[30-31]。Wu XY等[32]实验发现，芒柄花黄素作为成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）抑制剂，可阻断乳腺癌裸鼠体内FGFR2介导的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路，降低肿瘤细胞活性。杜倩倩等[33]研究发现，异鼠李素可协同索拉非尼抑制c-Raf/丝裂原激活蛋白激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖。而其余几种化合物与肿瘤相关性的报道不多，可作为学者后续研究的重点之一。该网络中排序前5位的靶蛋白分别为PTGS2、PRSS1、CAMKK2、HSP90AB1、PTGS1。Tan C等[34]研究发现，PTGS2可激活核因子κB（NF-κB）信号通路并减轻放疗后的DNA损伤。有研究表明，PRSS1低表达可阻碍ERK信号通路激活，抑制胃癌MGC803细胞的增殖[35]。CAMKK2存在于大鼠、小鼠及人类的受钙离子调控的蛋白激酶（66～68 kDa）中，研究证实其具有非常重要的生物学功能（如细胞增殖调控等），是潜在的药物干预靶点[36]。王明慧等[37]研究表明，HSP90AB1在非小细胞肺癌细胞中呈高表达，并且与肺腺癌患者预后不良有关。Chen WY等[38]发现，PTGS1编码基因的启动子可与转录辅助激活因子ZBTB46结合，使得后者表达下调，从而增加PTGS1抑制剂的敏感性，最终降低机体肿瘤恶性程度。鉴于上述靶蛋白在肿瘤方面的活性，笔者认为其可能成为山豆根治疗白血病等肿瘤的相关靶点。

从韦恩图可知，山豆根与白血病的交集基因共24个，提示山豆根对白血病的治疗具有多靶点协同作用的特点。由PPI图可见，该网络共包含节点24个、边142条，提示这些交集基因编码蛋白之间相互作用紧密。GO分析结果显示，疾病靶点主要针对生物过程，如缺乏配体的体外凋亡信号通路、凋亡过程的负调控、B细胞增殖的正调控、过氧化氢反应、细胞因子反应、MHC Ⅱ类生物合成过程的正调控等。KEGG通路富集分析发现，山豆根与白血病最相关的通路包括T细胞受体信号通路、JAK/STAT信号通路、HTLV-Ⅰ感染等。其中，HTLV-Ⅰ感染通路涉及的靶点基因有PIK3CG、ICAM1、CDKN2A、JUN、GSK3B、RB1、IL2;癌症通路涉及的靶点基因有PIK3CG、CDKN2A、JUN、GSK3B、BCL2、RB1、STAT1;EB病毒感染通路涉及的靶点基因有PIK3CG、ICAM1、JUN、BCL2、RB1。研究表明，c-JUN是原癌基因，是激活蛋白1（AP-1）复合物中活性最强的转录因子，活化后的c-JUN可参与调节细胞增殖、存活、凋亡等多个过程[39]。Chen KC等[40]研究发现，磷脂酶A2可通过c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化c-Jun蛋白来调节Fas/FasL的表达，从而诱导人慢性髓原白血病细胞株K562细胞凋亡。王应天等[41]研究显示，内皮细胞黏附因子1（ICAM-1）在乳腺癌、肝癌、结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织和正常组织，且高表达的ICAM-1与淋巴转移相关。Bcl-2是在调节细胞凋亡和阻滞细胞周期中发挥重要作用的抗凋亡蛋白。有研究表明，BCL2基因-938C>A启动子多态性可显著影响多种癌症细胞中该基因的启动子活性及Bcl-2蛋白的表达[2]。Nava-Rodríguez MP等[42]研究发现，慢性淋巴细胞白血病患者存在单等位基因RB1、DLEU等基因缺失。由上述研究可知，与白血病通路相关的基因包括c-JUN、ICAM1、BCL2、RB1，其可能是山豆根活性成分发挥白细胞治疗作用的靶点。此外，本研究挖掘出的PIK3CG、CDKN2A等其他基因，也可作为后续研究的对象之一。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法探讨了山豆根的活性成分、作用靶点和其对白血病的潜在作用机制，发现除已有报道的成分外，还有一些有潜在治疗作用的化合物以及靶点，可作为后续研究的重点之一，可为山豆根治疗白血病及后期的新药研发提供参考。

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（收稿日期：2019-04-28 修回日期：2019-08-27）

（編辑：张元媛）