基于SSR标记探讨三种金花茶植物的遗传多样性和遗传结构

陈海玲 路雪林 叶泉清 唐绍清

摘要：薄叶金花茶、小花金花茶和小瓣金花茶是三种濒危金花茶植物，为了解珍稀濒危植物遗传多样性和遗传结构，该研究利用微卫星标记对他们的7个种群共184个个体进行了遗传多样性和遗传结构分析。结果表明：11个位点共检测到等位基因92个。在物种水平上，小瓣金花茶平均等位基因数（NA）为3.9、有效等位基因数（NE）为2.328、观测杂合度（Ho）为0.520、期望杂合度（He）为0.501，高于薄叶金花茶和小花金花茶。在种群水平上，有效等位基因数（NE）在1.788～2.466之间，期望杂合度（He）在0.379～0.543之间;种群间遗传分化系数（FST）在0.1437～0.4533之间，种群间基因流（Nm）在0.3015～1.4889之间。AMOVA分子变异分析显示65.72%的变异存在于种群内。三种金花茶具有较低水平的遗传多样性和高水平的种群间遗传分化。STRUCTURE和PCoA种群遗传结构分析结果将取样种群分为2组，即薄叶金花茶和小花金花茶大部分个体分为一组，小瓣金花茶大部分个体分为一组。现存所有种群应根据实际情况尽快采取就地保护或迁地保护措施。

关键词：薄叶金花茶，小花金花茶，小瓣金花茶，遗传多样性，遗传结构

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2019）03-0318-10

薄叶金花茶（Camelliachrysanthoides）（2n=30）、小花金花茶（C.micrantha）（2n=30）和小瓣金花茶（C.parvipetala）（2n=30）是分布于我国广西西南部的三种金花茶植物（张宏达和任善湘，1998;梁盛业，1995）。薄叶金花茶分布于广西龙州县大青山，小花金花茶分布于广西凭祥市夏石镇，小瓣金花茶分布于广西宁明县，他们的分布区接近且极其狭窄。土地的开发和利用导致他们的生境被破坏;且因他们具有一定的观赏价值，部分野生植株被当地居民移植。因此，这3个物种的野生种群大小迅速减小，并呈片断化分布。薄叶金花茶和小花金花茶已被《中国高等植物受威胁物种名录》列为濒危物种（覃海宁等，2017）。

遗传多样性代表着物种适应能力与进化潜力，使其适应环境的改变（Frankhametal.，2002）。对珍稀濒危植物遗传多样性和遗传结构的研究不仅能了解导致物种濒危的机制，还可以为其保护策略与管理方式的制定提供理论基础（Segarra-Moraguesetal.，2005;Suetal.，2017）。利用分子标记的方法估算遗传变异和遗传结构已成为保护濒危物种的常用方法（Ryall，1998）。微卫星（Microsatellites）标记也叫简单重复序列（simplesequencerepeats，SSRs），具有高多态性、共显性、稳定性及重复性好和在真核生物中广泛存在等优点，是研究物种种群遗传学的一种有效工具（Lietal.，2013;Gyrgyetal.，2014;Mengetal.，2015）。微卫星标记广泛应用于揭示濒危植物种群遗传多样性和遗传结构（Yangetal.，2016;Maetal.，2015;Zhaoetal.，2017;Heetal.，2017）。

遗传多样性分析是评价和保护濒危植物的重要指标，它能为濒危植物制定有效的保护措施提供重要依据（Ciresetal.，2011）。关于薄叶金花茶、小花金花茶和小瓣金花茶遗传多样性和遗传结构的研究未见报道。因此，本研究利用微卫星标记评估三种金花茶7个种群遗传多样性和遗传结构，旨在了解他们的遗传多样性和遗传结构，依据研究结果提出保护策略。

1材料与方法

1.1材料

薄叶金花茶和小花金花茶在分类上没有分歧（张宏达和任善湘，1998;Ming&Bartholomew，2007），Ming&Bartholomew（2007）将小瓣金花茶归并到柠檬金花茶（Camelliaindochinensis），但是小瓣金花茶和柠檬金花茶在形态上存在一定的差异，因此，本研究仍按照张宏达和任善湘（1998）把小瓣金花茶作为独立的种进行采样。我们在整个分布区内共找到7个种群，3个小花金花茶种群和2个小瓣金花茶种群的分布及形态特征与原描述相符。种群BH1和BH2观察到的花直径最大只有3cm，与《中国植物志》（张宏达和任善湘，1998）描述的薄叶金花茶花的直径4～5.5cm不相符。但薄叶金花茶模式标本无花有果，新种发表时没有花的描述（张宏达，1979），花直径4～5.5cm是根据其他标本的花进行描述（叶泉清和薛跃规，2013）;BH2种群是南宁金花茶公园基因库的薄叶金花茶的引种地，种群BH1的分布地是薄叶金花茶模式标本的采集地龙州大青山，因此我们仍认定这两个种群为薄叶金花茶。每株植物选取2～3片新鲜的嫩叶放入有变色硅胶的封口袋中干燥后，用于总DNA的提取。材料来源、凭证标本信息等详见表1，种群分布地见图1。凭证标本存放于广西植物标本馆（IBK）。

1.2DNA提取和SSR分型

采用改良的CTAB法（Doyle，1987）提取叶片总DNA。从Luetal.（2014）和Liufuetal.（2014）为平果金花茶和淡黄金花茶开发的共59对微卫星引物中筛选出11对扩增条带清晰、多态性高的微卫星引物用于本研究。PCR扩增体系和程序参考Liufuetal.（2014）描述的方案。

1.3数据分析

微卫星分型数据利用Genepopversion4.1（Rousset，2008）檢测哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE），并对所得P值进行sequentialBonferroni校正（Rice，1989）。GenALEx6.5（Peakall&Smouse，2012）软件用于统计平均等位基因数（NA）、有效等位基因数（NE）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、固定系数（F）和多态性位点百分数（PPB）等多样性指数。分子变异方差分析AMOVA（Analysisofmolecularvariance）（Excoffieretal.，1992）利用Arlequin3.0（Excoffieretal.，2005）软件计算，并用该软件统计种间和种群间分化系数FST。基因流（Nm）估算利用公式Nm=（1-FST）/4FST。

遗传差异的主成分分析（PCoA）利用GenALEx6.5软件计算。STRUCTURE2.3（Pritchardetal.，2000）对7个种群进行分析，根据遗传成分的差异来分析种群遗传结构。参数设置为K=1-6，每个K值分别运行20次，Burn-in105次，MarkovChainMonteCarlo（MCMC）5×105迭代。运行结果利用在线软件STRUCTUREHARVESTER

（Earl&Vonholdt，2012）分析，计算出最佳遗传学组数K。利用GenALEx6.5中的Manteltest检测7个种群的遗传距离是否与地理距离（isolationbydistance，IBD）存在相关性。

2结果与分析

2.1种群遗传多样性

11个位点在三种金花茶184个个体共检测到等位基因92个，平均每个位点8.364个（表2）。7个种群11个位点共77次Hardy-Weinberg平衡检验，检测结果共有9次偏离平衡（P<0.05），经sequentialBonferroni校正后，只有位点TER8在种群NB3偏离平衡。所有数据可用于后续分析。

各种群遗传多样性指数计算结果见表3。在物种水平上，小瓣金花茶平均等位基因数（NA）、有效等位基因数（NE）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）分别是3.9、2.328、0.520、0.501，高于薄叶金花茶和小花金花茶。在种群水平上，7个种群平均等位基因数（NA）在2.7（NB1）～5.1（NB3）之间，平均值为3.8。有效等位基因数（NE）在1.788（NB1）～2.466（PT1）之间，平均值为2.161。观测杂合度（Ho）在0.409（NB1）～0.543（NB3）之间，平均值为0.487。期望杂合度（He）在0.379～0.543之间，平均值为0.471，最高在种群NB3，最低在种群NB1（表3）。

2.2遗传结构

分子变异方差分析（AMOVA）结果显示，三种金花茶种间变异占9.66%，种内种群间变异占24.62%，种群内变异占65.72%（表4）。在种内，他们的分子变异大部分都存在于种群内部，薄叶金花茶种群间变异占24.41%，种群内变异占75.59%;小花金花茶种群间变异占18.20%，种群内变异占81.80%;小瓣金花茶种群间变异占35.39%，种群内变异占64.61%。两种群间的遗传分化系数FST和基因流Nm如表5所示，FST在0.1437～0.4533之间，其中1组种群间FST值小于0.15;6组种群间FST值在0.15～0.25之间，14组种群间FST值大于0.25，说明种群间分化大。Nm在0.3015～1.4889之间，仅有3组种群间基因流大于1，种群间基因流较低。薄叶金花茶和小花金花茶种间分化系数FST为0.1731，薄叶金花茶和小瓣金花茶种间分化系数FST为0.2583，小花金花茶和小瓣金花茶种间分化系数FST为0.2068，薄叶金花茶与小花金花茶分化较小，小瓣金花茶与其他两种金花茶分化较大。

STRUCTURE和PCoA分析三种金花茶遗传结构的结果基本一致。STRUCTURE分析结果显示，7个种群184个个体最佳遗传学分组K=2（图2），此时薄叶金花茶的2个种群和小花金花茶的3个种群大部分个体分为一组，小瓣金花茶2个种群的大部分个体分为一组（图3）。PCoA分析结果（图4），7个种群所有个体分为两组，即薄叶金花茶的2个种群和小花金花茶的3个种群分为一组，小瓣金花茶2个种群分为一组，但是小瓣金花茶两个种群明显分开，其中种群PT1更接近于小花

金花茶的3个种群。Coord.1和Coord.2分别代表18.76%和12.59%的总变异。Manteltest结果表明7个种群间地理距离和遗传距离呈弱的正相关性但不显著（R2=0.0847，P=0.23）（图5）。

3讨论

3.1遗传多样性

遗传多样性水平是决定种群适应进化潜力的重要因素（Frankhametal.，2002）。一般来说，特有植物、珍稀濒危植物以及小而孤立的种群具有较低水平的遗传多样性（Spielmanetal.，2004;

Gaoetal.，2017）。与同属植物相比，三种金花茶的平均等位基因数NA和期望杂合度He较低（薄叶金花茶，NA=3.7，He=0.431;小花金花茶，NA=3.8，He=0.476;小瓣金花茶，NA=3.9，He=0.501），低于同属植物淡黄金花茶[C.flavida，A（等位基因数）=4.4，He=0.555]（卢永彬，2015），大理茶[C.taliensis，AR（等位基因丰富度）=6.776，Hs（基因多样性）=0.597]（Zhaoetal.，2014），还低于山茶（C.japonica，A=16.5，He=0.84）（Uenoetal.，2000）和茶（C.sinensis，A=4.3，He=0.64）（Yaoetal.，2012）。因此，三种金花茶均检测到相对较低水平的遗传多样性。影响物种遗传多样性的因素有多种，如生存环境、地理分布和繁殖方式等（Nybom，2004）。三种金花茶分布地非常狭窄，并且人们对他们野生植株的移植和对土地的开发利用，导致他们的野生种群大小下降，并呈片断化分布，所有种群的实际种群个体数都少于100。分布地狭窄、种群小和片断化分布可能导致了三种金花茶种群遗传多样性水平低。

3.2遗传结构

三种金花茶种群间存在高水平的遗传分化（表5），其中，遗传分化系数FST仅在种群NB1和NB2之间小于0.15，存在中等程度的遗传分化，其他种群之间存在较大（0.15<6组种群间FST值<0.25）或者很大的遗传分化（14组种群间FST值>0.25）（Wright，1968）。种内种群间FST在薄叶金花茶（0.2441）和小花金花茶（0.1437，0.2555和0.1612）呈较大的遗传分化，小瓣金花茶种内种群间FST呈很大的遗传分化（0.3514），大于大部分的种内种群间遗传分化值，可能是因为小瓣金花茶种群PT2是被长期孤立的小种群而形成的。这种很大的遗传分化结果在同属近缘种植物淡黄金花茶中也检测到（卢永彬，2015）。影響种群遗传分化的因素有多种，其中基因流是影响种群遗传分化的重要因素之一（陈小勇，2000）。7个种群间基因流Nm较小（表5），仅有3组种群间的Nm大于1，根据Wright（1931）理论，只有当种群间Nm>1时，基因流才能抵制遗传漂变的作用，并防止遗传漂变导致的种群间遗传分化的发生。花粉的扩散和种子的传播是植物基因主要的两种交流形式。在同属植物的研究中，淡黄金花茶（Weietal.，2017;彭国清和唐绍清，2017）、油茶（邓园艺等，2010）和大理茶（Liuetal.，2012）的种子或花粉传播能力有限，导致了种群间具有较少的基因流，并产生遗传分化。三种金花茶种群呈片断化分布，限制了花粉和种子在种群间的扩散，导致种群间存在较低水平的基因流，他们的野生种群小且孤立，受遗传漂变的影响较大。种群片断化分布、有限的传播能力、种群小和遗传漂变的影响，可能导致了三种金花茶高水平种群间遗传分化。

STRUCTURE和PCoA分析结果类似，取样种群最佳遗传学分组数为2，即薄叶金花茶和小花金花茶大部分个体分为一组，小瓣金花茶大部分个体分为一组，与这三种金花茶地理分布区域一致，说明薄叶金花茶与小花金花茶之间分化较小，小瓣金花茶与其他两种金花茶分化较大。表明薄叶金花茶的2个取样种群和小花金花茶的3个代表种群很可能是同一种植物。

3.3保护生物学意义

物种遗传多样性水平与其生存能力和适应能力密切相关（Hamrick&Godt，1996）。本研究表明三种金花茶具有较低水平的遗传多样性和高水平的种群间遗传分化。野外调查发现取样种群的生境都已遭到不同程度的破坏，如种群PT2分布地已被开发用来种植八角树;种群BH1分布地已被开发用来种植桉树;种群BH2分布地计划要修建公路，如果计划实施，公路将横穿BH2种群分布地，导致大部分植株被挖掉。因此，现存的所有种群应根据实际情况尽快采取就地保护或迁地保护措施，实施迁地保护措施时，每个种群都应选取代表性个体迁入种质资源库保护其种质资源。

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