福建山羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

林裕胜 江锦秀 张靖鹏 游伟 胡奇林

摘 要：【目的】对福清一山羊养殖场发生的山羊肺炎病原进行确诊，为福建山羊溶血性曼式杆菌的分离鉴定及检测提供研究基础。【方法】对剖检采取的组织进行细菌分离培养，随后对溶血性曼氏杆菌、羊口疮病毒、绵羊肺炎支原体和丝状支原体簇等羊常见呼吸道病原进行PCR检测，对分离菌进行16S rRNA基因克隆测序，并对分离株进行药物敏感性研究。【结果】细菌分离培养结果显示：从病死羊肺脏中分离到1株细菌;PCR检测结果显示，除溶血性曼氏杆菌有扩增条带外，未检测到其他病原;16S rRNA 测序结果显示：分离株16S rRNA基因序列与GenBank上公布的其他溶血性曼氏杆菌的同源性为97.1%～100.0%，与溶血性曼氏杆菌美国D171参考株同源性高达100%;以上结果表明分离菌为溶血性曼氏杆菌，命名为FJ-FQ2018。药物敏感性试验表明分离株对氟苯尼考、恩诺沙星、头孢噻吩、头孢唑啉、环丙沙星等高敏，对氨苄西林中敏，对多粘菌素B、林可霉素低敏。【结论】福建某养殖场引进的山羊发生肺炎后经病原分离鉴定确诊为溶血性曼氏杆菌感染，分离菌株对8种抗生素的耐药性存在差异。

关键词：山羊;溶血性曼氏杆菌;分离鉴定;药敏试验

中图分类号：S 852.61文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）03-326-05

Abstract： 【Objective】To identify and study the pathogen that caused the goat pneumonia in a farm in Fuqing，Fujian，and provide reference for the isolation，identification and detection of goat Mannheimia . 【Method】Bacterial isolation and culture were conducted on the tissues taken by autopsy on the diseased goats. ORF virus，mycoplasma，ovipneumonia and mycoplasma cluster were performed by PCR. A microorganism was isolated   and identified by 16S rRNA gene cloning and sequencing combined with PCR. Subsequently，sensitivities of the isolated strain toward various drugs were tested. 【Result】The PCR detection showed an unique amplified band of the isolated strain that matched Mannheimia haemolytica. The 16S rRNA sequencing of the strain shared 97.1%-100.0% similarities with those of other strains of M. haemolytica published in GenBank which included an 100% homology with the D171 strain. Positively confirmed to be of the M. haemolytica family，the isolate was code-named FJ-FQ2018. The drug sensitivity test showed the isolate to be highly sensitive to flufenicol，enoxacin，cephalothiophene，cefazoline，ciprofloxacin，et al，moderately sensitive to ampicillin，and slightly sensitive to polymyxin B and lincomycin. 【Conclusion】The pathogen of goat pneumonia isotaled from Fujian was a strain of M. haemolytica，and the  drug sensitivities of the isolate was deemed varions toward 8 antibiotics.

Key words： goat; Mannheimia haemolytica; isolation and identification; antibiotic resistance

0 引言

【研究意義】溶血性曼氏杆菌Mannheimia haemolytica属于巴氏杆菌科的一个成员，是牛、羊等反刍动物呼吸道疾病的主要病原菌之一，该菌通常寄生于上呼吸道[1-3]，属于条件致病菌。应激条件或病原感染（副流感病毒、绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种等）会导致动物机体的免疫机制下降或致病，使溶血性曼氏杆菌更容易侵入下呼吸道，在肺部定居增殖，并引起急性纤维素性肺炎，是引起牛“运输热”的主要病原之一[4-5]。有研究表明，全球约30%的病死牛与该菌有关，此外，北美国家每年因该菌造成的经济损失超过10亿美元，已经成为养羊业和养牛业主要疫病之一[6-8]。

【前人研究进展】近年来，由该菌引发的疾病吸引了越来越多兽医工作者的关注，我国云南、新疆、甘肃、四川、内蒙古、江苏等地均有牛、羊溶血性曼氏杆菌感染的报道[3，9]。由于该菌在无血培养基上很难生长，因此在初次分离时需在含有10%的血琼脂培养、巧克力培养基或含有4%牛血清培养基上培养，最佳生长温度为37℃，最佳pH值为7.0～7.5。鉴定方法主要包括生化鉴定、免疫学鉴定、分子生物学鉴定等，其中分子生物学鉴定主要以PCR为主。【本研究切入点】2018年7月，福建省某山羊养殖场羊群出现咳嗽症状，且有个别死亡，疑似溶血性曼式杆菌感染。鉴于福建省尚未见溶血性曼氏杆菌感染的报道，需要进一步查明该病的病原菌。【拟解决的关键问题】采集了病死羊的肺脏，进行细菌分离培养，对分离株进行形态学和分子生物学鉴定，同时开展药物敏感性试验，为溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及合理用药供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源及采集

病料来自福建省福清市某山羊养殖场病死羊。2018年7月，福清市某山羊养殖场从外地引种43头福清山羊，2周后有3头4月龄山羊出现体温升高、呼吸困难等症状，发病1周后1头死亡。对送检病死羊进行剖检，可见肺脏严重出血，气管内有大量白色分泌物，肺脏有纤维样渗出物、局部瘀血，心包积水，心叶肉变。无菌采取肺组织，4～8℃保存备用。

1.2 相关试剂

DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;细菌微量生化鉴定管、马血清购自HyClone公司;血液琼脂基础培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司;LB培养基购自生工生物工程（上海）有限公司;细菌革兰氏染色液购自广东凯微生物科技有限公司;药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司;ExTaq酶、pMD19-T载体、DNA标准品等均购自宝生物工程（大连）有限公司;胶回收试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司。

1.3 细菌的分离培养

无菌取肺脏深部组织划线接种于血琼脂平板上，37℃培养24 h，再挑取单个的溶血菌落，接种于LB培养基中，进行增菌培养。

1.4 生化试验

利用购买的细菌微量生化鉴定管，参照操作说明对分离的菌株测定生化指标，在37℃下培養24 h，随后观察结果。

1.5 引物设计与合成

溶血性曼氏杆菌种特异性鉴别引物和细菌16S rRNA通用引物分别参考文献[10-11]，羊口疮病毒、绵羊肺炎支原体、丝状支原体引物参照文献[12-13]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.6 细菌形态观察

挑取血琼脂平板上长势较好的单个菌落，进行革兰氏染色、镜检以及细菌形态观察。

1.7 PCR鉴定和16S rRNA基因序列鉴定

以提取的分离株的DNA作为模板，进行PCR鉴定和16S rRNA测序。PCR和16S rRNA反应体系20 μL：ExTaq Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，模板2 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL。PCR反应条件参照参考文献[10-11]进行。反应结束后PCR鉴定引物扩增产物和16S rRNA PCR扩增产物均经1%琼脂糖凝胶电泳检测，其中16S rRNA PCR产物进行回收，经连接、转化后送往福州尚亚生物技术有限公司进行测序。将测序结果与GenBank数据库中收录的其他细菌进行同源性分析（表1），采用DNAStar软件构建该菌的遗传进化树。

1.8 分离菌株的药敏试验

在生物安全柜中，将纯化后的分离株培养物用灭菌生理盐水稀释后用经酒精火焰灭菌的三角接种环涂布于血琼脂平板上，随后将药敏纸片粘贴在平板上，操作完成后将平皿放置37℃培养箱中培养24 h，按照美国临床实验室标准化委员会（NC-CLS） 2009 年标准进行记录。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养

无菌挑取病死羊肺组织，接种于血琼脂平板上，在37℃培养箱中培养24 h后可见培养基上有光滑、半透明的菌落，且有明显的溶血现象。

2.2 细菌染色特性

对分离的细菌进行涂片染色、镜检，可见革兰氏阴性短球杆菌，菌体两端钝圆且着色较深，菌体单个、散在排列。

2.3 生化试验结果

分离菌株具有溶血，氧化酶阳性，能够发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇，不能发酵阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、吲哚;靛基质试验阴性。生化试验结果与溶血性曼氏杆菌的生化特征相符合。

2.4 PCR鉴定

对采取的病料组织提取核酸后进行羊口疮病毒、绵羊肺炎支原体、丝状支原体等病原进行PCR检测，结果未有检测到扩增条带（图略）;同时利用溶血性曼氏杆菌特异性引物对分离菌株进行PCR扩增，反应结束后扩增产物经琼脂糖电泳后结果显示，分离株在453 bp处有一条很亮的条带，而阴性对照未扩增出任何条带（图1）。

2.6 溶血性曼氏杆菌分离菌株的药敏试验

分离本菌对氟苯尼考、恩诺沙星、卡那霉素、头孢噻吩、庆大霉素、头孢唑啉、环丙沙星、链霉素、四环素高敏，对氨苄西林中敏，对多粘菌素B、林可霉素低敏。表明该地区分离的溶血性曼氏杆菌对抗生素的耐药性较低。

3 讨 论

溶血性曼氏杆菌是导致牛、羊等反刍动物肺炎和新生羔羊急性败血症的病原菌，近年来对于溶血性曼氏杆菌的报道屡见不鲜，该菌被认为是引起大角羊致死性肺炎的主要致病菌[14-16]。

溶血性曼氏杆菌分离较为困难。Shanthalingam等[17]于2009-2010年对美国3个不同地区的大角羊肺脏进行溶血性曼氏杆菌的分离和PCR鉴定，结果显示病原的分离率为3%，而PCR的检出率为77%;冯旭飞等[18]于2013年对四川地区40份绵羊肺脏进行分离，分离到8株，分离率为20%，而PCR检出率为80%;;徐慧等[7]于2009年对新疆地区PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌的29份样品进行分离，仅分离到3株溶血性曼氏杆菌，表明该菌的分离率较低。

本试验从病变肺脏组织中分离出1株细菌，经革兰氏染色镜检、划线培养和溶血试验结果表明，分离株为革兰氏阴性杆菌，其在血琼脂平板上呈现针尖大小的菌落，且有明显的溶血现象，生化试验结果表明分离菌株具有溶血，氧化酶阳性，能够发酵葡萄糖、蔗糖等，不能发酵阿拉伯糖、鼠李糖等;靛基质试验阴性，符合溶血性曼氏杆菌的生化特征。PCR作为快速诊断技术，在病原鉴定过程中得到广泛应用，有些病原的诊断还以此作为金标准。因此本试验选择用特异性PCR来进一步鉴定分离得到的细菌，同时为了进一步验证该菌是否是溶血性曼氏杆菌，本研究对16S rRNA 基因序列进行测序，测序结果与GenBank公布的细菌进行比对，比对结果表明本研究的分离菌与GenBank上公布的其他溶血性曼氏杆菌的同源性为97.1%～100.0%，与美国D171参考株同源性高达100%;从构建的溶血性曼氏杆菌16S rRNA的系统进化树分析可见，分离株FJ-FQ2018与美国USDA-ARS-USMARC-184等5株参考株、英国NCTC10609参考株、丹麦PHL213参考株、日本Th1405参考株、比利时MB1401参考株、中国广东GDZJcattle2014参考株和中国新疆XJKLMY-10-NF参考株亲缘关系较近，处于同一进化分支上，与印度NIVEDI/MHS-2参考株亲缘关系较远，以上试验结果证明分离菌为溶血性曼氏杆菌。

当前溶血性曼氏杆菌耐药性研究表明，有些菌株已对某些药物产生了耐药性，如磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类药物[19-21]，由于抗生素治疗是治疗本病的最佳疗法，因此了解菌株的耐药性对临床治疗具有重要意义。本研究药敏试验结果表明： 分离菌对氟苯尼考、恩诺沙星、卡那霉素、头孢噻吩、庆大霉素、头孢唑啉、环丙沙星、链霉素、四环素高敏，对氨苄西林中敏，对多粘菌素B、林可霉素低敏。该结果与Katsuda等[19]和Lubbers等[20]研究结果明显不一致，但与冯旭飞等[18]研究结果一致，侧面证实了不同地区分离株的耐药性存在一定差异。

本研究从发生肺炎山羊肺脏中分离到溶血性曼氏杆菌，病死羊的症状和病理变化与溶血性曼氏杆菌引起的疾病相似，但该分离菌是否为本次山羊发病的病原，尚需进行动物回归试验证实。

本研究首次报道了福建省羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定以及耐药性，为福建省羊溶血性曼氏杆菌病的诊断方法研究奠定了基础，同时为该病的科学防控及合理用药提供了理论依据。

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（責任编辑：张 梅）