黄秋葵根结线虫病的病原鉴定

练冬梅 赖正锋 姚运法 洪建基

摘 要：根结线虫种类繁多，鉴定黄秋葵根结线虫病病原种类，可为黄秋葵根结线虫病害防治提供信息基础，并为今后开展黄秋葵根结线虫病的抗病种质筛选、抗病育种提供重要理论依据。从被侵染的黄秋葵根组织中分离雌虫，并采用形态学、同工酶和rDNAITSPCR相结合的方法鉴定黄秋葵根结线虫病病原种类。结果表明：危害黄秋葵根结线虫病的病原为南方根结线虫Meloidogyne incognita。

关键词：黄秋葵;根结线虫病;病原鉴定

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.010

Abstract：There were many species of rootknot nematodes. Identifying the pathogenic species of rootknot nematode disease on okra can provide information basis for the prevention and control of rootknot nematode disease on okra， and provid important theoretical basis for the selection of diseaseresistant germplasms and diseaseresistant breeding of rootknot nematode disease in the future.The females were isolated from the infected root tissues of okra and the pathogenic species of okra rootknot nematode disease were identified by morphology， isozyme and rDNAITSPCR.The results showed that the rootknot nematodes which harmed okra were Meloidogyne incognita.

Key words：Okra; Rootknot nematode; Pathogen identification

黃秋葵Okra为锦葵科Malvaceae秋葵属Abelmoschu的一个种[1]，又名秋葵、补肾草、咖啡葵等。原产于非洲，自20世纪90年代初引入我国，现国内各地均有栽培。黄秋葵作为一种特色的保健型蔬菜，种植面积不断扩大，福建漳州地区每年黄秋葵种植面积累计达到1300多hm2，在福建省建宁、泰宁和将乐等诸县种植的黄秋奏品种洋辣、痴椒也已有百年之久[2]。由于黄秋葵生产规模化、设施化以及连作障碍严重，根结线虫病已成为黄秋葵的最重要病害之一，极大地降低了黄秋葵的产量和质量[3]。黄秋葵植株根部受根结线虫侵染后，侧根和须根上产生根结，呈串珠状或鸡爪状，表面粗糙，容易龟裂腐烂。由于根系畸变膨大，导致根部吸收营养成分和水分的运输功能遭到破坏，从而引起植株矮化、褪绿、落叶甚至死亡[4]。

我国已报道的根结线虫种类为57种，其中能引起蔬菜发生根结线虫病的主要为南方根结线虫Meloidogyne incognita[5]、象耳豆根结线虫Meloidogyne enterolobii[6]、爪哇根结线虫Meloidogyne javanica[7]、北方根结线虫Meloidogyne hapla[8]、花生根结线虫Meloidogyne arenaria[9]。常规的根结线虫种类鉴定主要通过形态学鉴定、鉴别寄主及生化鉴定，近十几年来，分子生物学技术的发展，为根结线虫的准确鉴定提供了重要手段。根结线虫种间存在显著的致病差异，对黄秋葵根结线虫种类的鉴定是防治根结线虫病的重要前提。本研究在福建省漳州市黄秋葵种植区域监测到黄秋葵根结线虫的症状，通过病原分离鉴定，确定黄秋葵根结线虫种类，为黄秋葵根结线虫病的防治提供信息基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在福建省漳州市采集黄秋葵根结线虫发病植株根系，清洗干净，挑取根系中淡黄色的单卵块至1.5 mL离心管中，用1%NaClO溶液消毒5 min后，无菌水清洗3次，加入无菌水室温下孵化24 h后接种于易感黄秋葵上进行培养，待后期鉴定。供试爪哇根结线虫虫源由海南省农业科学院植物保护研究所惠赠，并长期培养保存于易感番茄上。

1.2 病原线虫的分离与鉴定

1.2.1 会阴花纹形态学鉴定 根结线虫接种8周后，取被侵染的黄秋葵根组织进行雌虫分离，分离出的单头雌虫，根结线虫成熟雌虫会阴花纹制作和观察参照刘维志[10]和赵雷等[11]的方法。

1.2.2 同工酶分析 参照胡凯基[12]的方法，挑取20头雌幼虫置于1.5 mL的离心管中，加入15 μL酶浸提液，研碎，将酶提取物加入到7%分离胶、4%浓缩胶、胶厚1.0 mm的胶孔中，运用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行同工酶酯酶（EST）分析。电泳结束后参照胡凯基[12]的方法进行EST染色，以已鉴定的爪哇根结线虫Meloidogyne javanica为对照。酯酶表型的判读按照Esbenshade等[13]的方法。

1.2.3 rDNA的ITS区PCR鉴定 采用Vrain等[14]设计的引物18S（5′TTGATTACGTCCTGC CCCTTT3′）和28S（5′TTTCACTCGTTACTAAGG3′）进行rDNAITS扩增，引物由上海生工公司合成。将黄秋葵根结线虫雌虫置于200 μL的PCR管中，加入10 μL灭菌水，用10 μL枪头将雌虫刺破，内含物溢出，再加入8 μL10×PCR Buffer，并且以终度60 μg·mL-1的蛋白酶K处理，之后将样品置于-70℃30 min，65℃下温育1 h，95℃10 min，最终常温下12000 r·min-1离心≥1 min，上清液可作PCR模板。PCR反应总体积为25 μL，包含12.5 μL Mix、正反引物各1 μL、线虫DNA粗提液5 μL，加灭菌水补充至25 μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环， 72℃充分延伸10 min，4℃保温。取PCR产物5 μL在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统观测拍照。剩余PCR产物通过回收、纯化、克隆和测序后于NCBI上进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 会阴花纹形态学观察

根结线虫雌虫的会阴花纹背弓较高，花纹呈椭圆形，背弓由平滑到波浪形的线纹组成，一些线纹在侧面分叉，无明显侧线，对照文献资料[15]，初步确定黄秋葵根接线虫为南方根结线虫Meloidogyne incognita。

2.2 同工酶分析结果

对纯化培养的黄秋葵根结线虫雌幼虫的酯酶进行电泳分析。经同工酶的特异性染色后，黄秋葵根结线虫酯酶谱型为I2型，为南方根结线虫Meloidogyne incognita酯酶谱型。

2.3 rDNAITS分子鉴定结果

以黄秋葵根结线虫粗提液为模板，用引物18S和28S扩增rDNA的ITS区序列。结果得到ITS片段均为750 bp左右。对rDNAITS区序列进行克隆与测序，产物大小为765 bp，将测序结果提交NCBI进行分析，与已知Meloidogyne incognita ITS区编码序列相似性达到99%，由此确定黄秋葵根结线虫病的病原为南方根结线虫Meloidogyne incognita。

3 讨论与结论

黄秋葵是兼食用和观赏的作物，由于根结线虫病是一种隐蔽性强的植物病害，不易被及时发现，所以根结线虫侵染后往往导致黄秋葵产量大大降低，植株叶片发黄而失去观赏价值。因此，应当进一步广泛、深入地开展黄秋葵根结线虫病的研究，为黄秋葵育种和根结线虫病防治提供技术支持。目前国内天津地区为害黄秋葵的根结线虫种类是南方根结线虫Meloidogyne incognita[16]，国外也有报道[3]为害黄秋葵的根结线虫种类是南方根结线虫Meloidogyne incognita和象耳豆根结线虫Meloidogyne enterolobii。由于寄主及环境条件的差异，根结线虫形态上会存在着一定的变异。形态特征较多依赖雌虫会阴花纹的观察，表型判定标准对常见根结线虫种群鉴定准确而有效，rDNAITSPCR技术是通过对区序列进行测序，并将测序获得的序列与已知线虫序列进行对比，从而获得未知线虫属信息的方法，该方法在根结线虫上已得到广泛应用。因此本研究利用会阴花纹形态学、同工酶分析和分子生物学手段相结合的方法对黄秋葵病原线虫进行种类鉴定，发现黄秋葵根结线虫病的病原为南方根结线虫Meloidogyne incognita。

参考文献：

[1]NIPAPORN S，LEONARD M C S，RENKO D V，et al.Physicochemical properties of pectins from okra[J].Food Hydrocolloids，2009，24（1）：35-41.

[2]曹亮，周佳民，朱校奇，等.黄秋葵种质资源、引种栽培及功效成分研究进展[J].中南药学，2012，10（9）：695-697.

[3]MARIN M V，SANTOS L S，GAION L A，et al.Selection of resistant rootstocks to Meloidogyne enterolobii and M.incognita for okra（Abelmoschus esculentus L.Moench）[J].Chilean Journal of Agricultural Research，2017，77（1）：58-64.

[4]练冬梅，姚运法，洪建基，等.闽南地区黄秋葵主要病虫害防治技术[J].福建农业科技，2016（1）：53-55.

[5]ABAD P，GOUZY J，AURY J M，et al.Genome sequence of the metazoan plantparasitic nematode Meloidogyne incognita[J].Nature Biotechnology，2008，26（8）：909-915.

[6]YANG B J，EISENBACK J D.Meloidogyne enterolobii n.sp.（Meloidogy nidae），a rootknot nematode parasitizing pacara earpod tree in China[J].Journal of Nematology，1983，15（3）：381-391.

[7]OPPERMAN C H，BIRD D M，WILLIAMSON V M，et al.Sequence and genetic map of Meloidogyne hapla：A compact nematode genome for plant parasitism[J].Proc Natl Acad Sci，2008，105（39）：14802-14807.

[8]宾淑英，姚圣梅，林进添，等.花生根结线虫对花生植株主要生理指标的影响[J].华中农业大学学报，1999，18（2）：121-124.

[9]何元，潘沧桑.南方根结线虫和爪哇根结线虫的发育[J].厦门大学学报（自然科学版），2000，39（4）：537-546.

[10]刘维志.植物线虫志[M].北京：中国农业出版社，2004：313-459.

[11]赵雷，郭恺，洪文英，等.浙江省蔬菜上2种根结线虫的形态学鉴定[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2010，36（6）：623-629.

[12]胡凯基.酯酶在根结线虫分类上应用的研究[J].林业科学研究，1988，1（6）：650-656.

[13]ESBENSHADE P R，TRIANTAPHYLLOU A C.Use of enzyme phonotype for indentification of Meloidogyne species[J].Journal of Nematology，1985，17（1）：6-20.

[14]VRAIN T C，WAKARCHU K D A，LESQUE A C，et al.Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group[J].Fundamental and Applied Nematology，1992，15（6）：563-573.

[15]馮志新.植物线虫学[M].北京：中国农业出版社，2001：135-154.

[16]姚玉荣，霍建飞，郝永娟，等.天津地区温室蔬菜根结线虫种类的多重PCR快速鉴定[J].北方园艺，2018，42（7）：49-52.

（责任编辑：柯文辉）