水稻OsTZF3基因敲除和过量表达载体的构建与遗传转化

周淑芬 刘华清

摘 要：为进一步研究水稻OsTZF3基因的生物学功能，利用日本晴基因组的OsTZF3基因序列，构建了OsTZF3的CRISP/Cas9敲除表达载体pKTZF3和过量表达载体pCXUNTZF3;并通过农杆菌介导法导入粳稻日本晴胚性愈伤组织中，分别获得了pKTZF3和pCXUNTZF3转化再生植株55个和42个克隆;进一步通过PCR法鉴定了35个克隆转pKTZF3植株和10个克隆转pCXUNTZF3植株。

关键词：水稻;基因敲除;过量表达;遗传转化;OsTZF3

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.001

Abstract：In order to further study the biological function of OsTZF3 gene in rice， the CRISP/Cas9 knockout expression vector pKTZF3 and overexpression vector pCXUNTZF3 of OsTZF3 were constructed by using the sequence of OsTZF3 gene in Nipponbare. 55 transformants of pKTZF3 and 42 clones of pCXUNTZF3 were obtained through Agrobacteriummediated transformation. Among them， 35 clones of pKTZF3 and 10 clones of pCXUNTZF3 were further identified by PCR detection.

Key words：Rice; Gene knockout; Overexpression; Transformation; OsTZF3

CCCH蛋白是一類特殊的锌指蛋白，具有DNA和RNA结合的特性，在植物不同组织、发育阶段及环境胁迫中具有多种功能。串联锌指（tandem zinc finger， TZF）基因是CCCH型锌指蛋白基因的一个亚家族，其编码蛋白包含一个保守的TZF模体，参与了多种细胞过程。进化上最保守的TZF模体是由中间隔18个氨基酸的2个相同CX8CX5CX3H结构域组成[1-2]。在植物还含有一类特殊的TZF模体，其结构特征为CX7-8CX5CX3HX16CX5CX4CX3H，即由中间间隔16个氨基酸的2个不同CX8CX5CX3H结构域组成，且其上游50个氨基酸处存在1个富含精氨酸区，因此这类基因又称为RRTZF型锌指蛋白基因[3]。植物特有TZF基因受多种发育阶段和环境信号的影响，在植物中的表达模式呈多样化[4]。

随着分子生物学技术的发展及越来越多生物基因组测序的完成，反向遗传学技术已成为基因功能分析的重要手段。在植物中，常用的反向遗传学研究手段包括基因过表达、基因敲除/基因打靶、基因沉默（反义RNA和RNAi等）和基因激活等。对功能冗余基因的分析常用基因过量表达方法，基因敲除或基因沉默技术则是基因功能研究的主要方法。CRISPR/Cas9技术[5]是近年新兴的一项基因组定点编辑技术，由与特异DNA序列反向互补的sgRNA和核酸内切酶Cas9组成，前者负责识别特异基因靶点，后者实现DNA的切割。该系统无基因序列、细胞类型和物种的限制，简单高效、费用便宜，受到广大研究者的青睐[6]。水稻OsTZF3是一个RRTZF型锌指蛋白基因，其他功能尚未被研究。本研究构建了水稻OsTZF3基因的CRISPR/Cas9敲除和过量表达载体并转化水稻，为进一步研究其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

转基因受体材料为粳稻（Oryza sativa L.ssp.Japonica）日本晴（Nipponbare）。

1.2 载体与菌株

大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌LBA4404和植物过表达载体pCXUN，均由福建省农业遗传工程重点实验室保存。

1.3 主要试剂

CRISPR/Cas9试剂盒（北京唯尚立德公司），primerstar高保真酶、限制性内切酶、DNA Ligation Kit（TaKaRa公司），Taq DNA 聚合酶、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒（天根生化科技有限公司），引物合成、DNA测序（上海博尚生物技术有限公司），潮霉素（Roche 公司），组织培养试剂（Sigma公司）。

1.4 CRISPR/Cas9载体构建

载体构建采用北京唯尚立德公司提供的植物 Cas9/gRNA 质粒构建试剂盒（Catalog.No.VK00501），具体步骤如下：1）将合成的gRNA靶点引物对溶解并稀释成10 μmol·L-1，各取

5 μL加15 μL H2O混合成25 μL最终体系，并按如下程序合成引物二聚体：95℃变性3 min，自然冷却或在PCR仪中以3℃·min-1的速率降至25℃，16℃ 5 min。2）取Cas9/gRNAVector 1 μL、引物二聚体1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、10× T4 DNA Ligase Buffer 1 μL、H2O 6 μL，混合成10 μL反应体系，16℃水浴2 h，获得引物二聚体与载体的连接产物。3）取连接最终产物5～10 μL，热激法转入DH5a感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，次日挑取3～5个白色单菌落摇菌培养并测序，测序引物序列5′AGCCATGAATAGGTCTATGAC 3′。获得正确的引物二聚体与VK00501连接的最终敲除表达载体，并电激转化农杆菌LBA 4404，于-80℃下保存备用。

1.5 过表达载体构建

以日本晴基因组DNA为模板，用TZF3F和TZF3R引物（表1）及高保真酶（PrimeSTAR）PCR扩增获得OsTZF3基因全长。用Xcm I酶切pCXUN质粒，获得3′末端突出一个T碱基的线性骨架載体，与OsTZF3基因的PCR产物连接，经酶切和测序验证后获得正确的OsTZF3植物过表达载体并电激转化农杆菌LBA 4404，于-80℃下保存备用。

1.6 水稻遗传转化

以日本晴的幼胚诱导愈伤组织，并用于随后的转化。水稻愈伤组织的诱导、继代及与农杆菌的共培养，抗性愈伤组织的筛选及再生等相关的培养基和具体的试验步骤参照文献[7]进行。

1.7 转化植株的检测

以CTAB法[8]提取叶片基因组DNA为模板，PCR扩增筛选转基因植株，PCR引物如表1所示。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s，56～60℃退火45 s（温度依据GC含量高低而定），72℃延伸45 s至3 min（时间根据扩增长度而定，1 kb·min-1），共35个循环;72℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 OsTZF3基因的生物信息学分析及gRNA靶序列的设计

水稻OsTZF3基因包含1个外显子，CDS全长2250 bp，编码749个氨基酸，含有1个CHCH和1个TZF模体。将其CDS序列输入CRISPR/Cas9靶点设计软件（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html）获得一系列gRNA靶序列（长度为20 bp），选取位于TZF模体上游的靶序列，在NCBI中进行同源比对分析，确定了1条与水稻基因组中其他序列同源性较低的gRNA靶序列5′AGCCACCAGACGCCGCACAG 3′，在该gRNA靶序列5′末端加上接头CAG，其反向互补序列5′末端加上接头AAC，构成1对完整的gRNA靶点引物，并送往上海博尚生物技术有限公司合成。

2.2 CRISPR/Cas9敲除载体的获得

将上述合成的gRNA靶点正反义引物按照材料与方法1.4所述，首先引物经过变性退火形成具有黏性末端的引物二聚体，然后与具有同样黏性末端的线性骨架载体VK00501连接，通过热激法转化大肠杆菌，挑单克隆测序获得了gRNA 在CRISPR/Cas9骨架载体中正确插入的重组子，命名为pKTZF3，进一步通过电激法将构建正确的重组载体导入农杆菌感受态细胞LBA4404，经过菌液PCR鉴定正确的单菌落，保存于-80℃保存备用。

2.3 过表达载体 pCXUNTZF3的获得

设计OsTZF3基因全长引物TZF3F和TZF3R（表1），以日本晴基因组DNA为模板，用高保真酶（TaKaRa）PCR扩增获得OsTZF3基因全长。PCR产物胶回收后用普通Taq酶加A尾巴，通过TA克隆方法与pCXUN线性载体连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含卡那霉素的LB培养基上。挑单菌落摇菌提质粒后，经酶切鉴定获得正向连接的重组载体，并送往公司测序，获得序列正确的载体，命名为pCXUNTZF3。电激法导入农杆菌感受态细胞LBA4404，使用菌液PCR扩增目的基因，能获得目的片段的单菌落保存于-80℃保存备用。

2.4 农杆菌介导的水稻遗传转化

将构建好的质粒pKTZF3转化到粳稻日本晴胚性愈伤组织中，获得了转化再生植株55个克隆，CTAB法提取每个再生植株基因组DNA，用表1的CZF和CZR引物PCR扩增，其中35个克隆能扩增出目的条带。进一步对上述能扩增出目的条带的PCR扩增产物进行测序，结果显示所有PCR阳性植株均含有本试验设计的gRNA靶序列，说明了gRNA靶序列成功导入水稻基因组中。同时，以上述鉴定的35个克隆转基因植株为模板，用KTZF3F2 和KTZF3R2引物PCR扩增靶突变区，送往公司测序发现35个转基因植株中均未检测到靶基因突变，暗示了该gRNA序列的活性低或不具有活性。

另外，将构建好的过表达载体pCXUNTZF3转化粳稻日本晴胚性愈伤组织，共获得转化再生植株42个克隆，CTAB法提取再生植株基因组DNA，用UbiF和KTZF3R2引物PCR扩增其中10个田间种植成活的转化再生植株，结果显示均能扩增出预期条带，说明成功获得了OsTZF3基因的过表达转基因水稻。

3 讨论与结论

植物RRTZF型锌指蛋白基因在植物生长发育及胁迫反应中起着重要的作用。在拟南芥的RRTZF型锌指蛋白基因的功能研究中发现此类基因具有功能冗余现象，过量表达是功能冗余基因分析的常用方法，但过量表达容易出现异位表达，基因敲除克服RNAi拟敲除技术抑制不彻底的缺陷，因此过量表达技术结合基因敲除技术可以更准确地反映冗余基因的功能。本研究成功构建了水稻RRTZF型锌指蛋白基因OsTZF3敲除表达载体和过量表达载体，并通过农杆菌介导法，获得了35个转敲除载体的转基因水稻和10个克隆的转过表达载体的转基因水稻，为进一步研究OsTZF3基因的生物学功能奠定了基础。

CRISPR/Cas9技术是近年新兴的一项切割效率极高的基因组定点编辑技术，是基因功能研究中的一种非常有效的工具。虽然该CRISPR/Cas9系统几乎能剪切PAM序列（NGG）之前的任何序列，但对于预测的所有靶位点并不是总能成功进行编辑。CRISPR/Cas9系统的切割效率受到gRNA的影响，Liang等[9]认为植物中有活性的gRNA序列具有以下4个特点：①gRNA序列G/C含量为30%～80%;②gRNA二级结构除茎环1外，其他结构必须完整;③与其他gRNA序列的同源性12个碱基，保守区小于或等于7个碱基;④gRNA序列自身碱基配对小于或等于6个。本研究对OsTZF3基因的gRNA序列进行分析，虽然gRNA序列均满足上述有活性gRNA序列特点，但对其获得的35个转基因植株进行靶突变区检测却未发现突变体。由于植物基因组编辑需要花较长时间才能获得转基因植株，因此除了对gRNA序列进行评估外，还需多设计几个gRNA序列，以保证获得具有靶基因突变的植株。

参考文献：

[1]CARRICK D M，LAI W S，BLACKSHEAR P J.The tandem CCCH zinc finger protien tristetraprolin and its relevance to cytokine mRNA turnover and arthritis[J].Arthritis Res Ther，2004，6（6）：248-264.

[2]IUCHI S，KULDELL N.Zinc finger proteins：From atomic contact to celluar function[M].Georgetown，New York：Kluwer Academic/Plenum Publishers，2005.

[3]WANG D，GUO Y H，WU C A，et al.Genomewide analysis of CCCH zinc finger family in Arabidopsis and rice[J].BMC Genomics，2008，9：44-54.

[4]POMERANZ M，FINER J，JANG J C.Putative molecular mechanisms underlying tandem CCCH zinc finger protein mediated plant growth，stress and gene expression responses[J].Plant Signaling & Behavior，2011，6（5）：647-651.

[5]HWANG W Y，FU Y F，REYON D，et al.Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPRCas system[J].Nat.Biotechnol，2013，31（3）：227-229.

[6]CHEN K，GAO C.Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements[J].Plant Cell Rep，2014，33（4）：575-583.

[7]蘇军，胡昌泉，翟红利， 等.农杆菌介导籼稻明86高效稳定转化体系的建立[J].福建农业学报，2003，18（4）：209-213.

[8]MURRY MG，THOMPSON WF.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res，1980，8（19）：4321-4326.

[9]LIANG G，ZHANG H，LOU D，et al.Selection of highly efcient sgRNAs for CRISPR/Cas9based plant genome editing[J].Scientific Reports，2016，6：21451，DOI：10.1038/srep21451.

（责任编辑：柯文辉）