HPLC法同时测定保健食品中10种水溶性维生素

周津 罗格莲 何文胜

摘 要：本研究采用高效液相色谱法，同时检测保健食品中VB1、VB2、烟酸、烟酰胺、VB6（吡多胺、吡哆醛、吡哆辛）、泛酸钙、VB12、VC共10种水溶性维生素。样品经Agilent C18柱（4.6mm×250mm，5μm）分离，使用PDA检测器，流动相为甲醇与0.025mol/L磷酸二氢钾溶液（加磷酸调节pH=3.1），梯度洗脱。结果表明，10种水溶性维生素得到良好分离，分离度均大于1.5。10种水溶性维生素线性范围为0.2～50μg/mL，相关系数为0.999 5～1.000 0，平均回收率为92.7%～103.7%，[RSD]为0.37%～2.80%（[n]=3）;10种水溶性维生素的检测限为1.5～9.0mg/kg。该方法简单、方便、快速且准确，可同时测定保健食品中10种水溶性维生素。

关键词：高效液相色谱法;同时检测;保健食品;水溶性维生素

中图分类号：O657.63;TS218 文献标识码：A 文章编号：1003-5168（2019）34-0131-04

Simultaneous Determination of 10 Water-soluble Vitamins

in Health Foods by HPLC

ZHOU Jin LUO Gelian HE Wensheng

（Fujian Vocational College of Bioengineering，Fuzhou Fujian 350007）

Abstract： In this study， high performance liquid chromatography （HPLC） was used to detect the contents of VB1， VB2， nicotinic acid， nicotinamide， VB6 （pyridoxamine， pyridoxal， pyridoxine）， calcium pantothenate， VB12 and VC 10 kinds of water-soluble vitamins. The samples were separated on an Agilent C18 column （4.6mm×250mm ， 5 μm） using a PDA detector. The mobile phase was eluted with methanol and 0.025mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （adjusted to pH=3.1 with phosphoric acid）. The results showed that 10 kinds of water-soluble vitamins were well separated， the separation degree was more than 1.5. 10 kinds of water-soluble vitamins linear range of 0.2～50μg/mL， the correlation coefficient of 0.999 5～1.000 0， the recovery rate of 93% to 103%，[RSD] 0.37%～2.80%（[n] = 3）. The detection limits of 10 kinds of water-soluble vitamins were 1.5～9.0mg/kg. The method is simple， convenient， fast and accurate， and can simultaneously measure 10 kinds of water-soluble vitamins in health food.

Keywords： HPLC;simultaneous detection;healthy food;water-soluble vitamin

維生素是一类必须从食物中摄取的有机化合物，多为酸、醇和酚类物质。维生素的种类很多，按溶解性可分为脂溶性维生素（A、D、E、K）和水溶性维生素（B族维生素和VC）。B族维生素有12种以上，被世界一致公认的有9种。维生素B族包括维生素B1、维生素B2、维生素B3（烟酸、烟酰胺）、维生素B5（泛酸钙）、维生素B6（吡哆辛、吡哆醛、吡多胺）、维生素B12（钴胺素）、维生素B9（叶酸）、维生素B7（生物素）等[1]。

随着复合维生素制剂及高档营养品的出现，同时检测食品药品中水溶性维生素的含量引起人们的广泛关注。现行标准分析方法多为微生物法、分光光度法，这类方法耗时、费力，已难以满足当前分析要求和发展趋势;也有采用HPLC测定水溶性维生素的方法，但大多限于单一维生素的测定;仅有《保健食品的高效液相色谱测定方法》（GB/T 5009.197—2013）同时测定保健食品中VB2、VB6、烟酸、烟酰胺等4种水溶性维生素，但该方法使用离子对试剂、对色谱柱消耗较大，且仪器难以平衡。目前，也有关于保健食品中多种水溶性维生素同时测定的文献报道[2-5]，但测定种类难以覆盖常见水溶性维生素种类，且尚未有关于水溶性维生素的提取方法的研究。

因此，研究出能同时准确、快速地检测多种水溶性维生素含量的测定方法具有重要的意义。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

仪器：岛津LC-20A型高效液相色谱仪，配有SPD-M20A型PDA检测器，LCsolution色谱工作站;超声波清洗器（德国Elma公司P系列）;pH计（瑞士梅特勒公司SevenCompact系列）;分析天平（瑞士梅特勒公司，感量为0.1mg）;分析天平（瑞士梅特勒公司，感量为0.01mg）;样品粉碎机等。

1.2 材料与试剂

主要试剂：甲醇（色谱纯）、盐酸（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）;实验用超纯水由Miliipore纯水机制得，其电阻率不大于18.2MΩ。

标准品：VB1（纯度100%）、VB2（纯度99.1%）、烟酸（纯度99.9%）、烟酰胺（纯度99.9%）、泛酸钙（纯度97.5%）、VB12（纯度89.7%）、VC（纯度100%），以上标准品来自中国食品药品检定研究院;吡多胺（纯度98.0%）、吡哆醛（纯度98.0%）、吡哆辛（纯度100.0%），以上标准品来自东京化成。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse C18柱（4.6×250mm，5μm）;流动相：A为0.01mol/L磷酸盐缓冲液（用磷酸调节pH至3.1），B为甲醇;流速：1.0mL/min;柱温：室温;进样量：20μL。

检测波长：泛酸为210nm;VB1、VC、烟酸、烟酰胺、VB2为260nm;吡哆胺、吡哆辛、吡哆醛均为280nm;VB12为360nm。

1.4 对照品溶液的配制

1.4.1 各对照品溶液的制备。精密称取VB12、烟酸、烟酰胺、泛酸钙、吡哆胺、吡哆醛、吡哆辛标准品各10mg，加水溶解配制成浓度为1.0mg/mL的对照品溶液;准确称取VC、VB1标准品各10mg，用0.01mol/L鹽酸配制成浓度为1.0mg/mL的对照品溶液;准确称取VB2标准品10mg，加水溶解配制成浓度为200μg/ml的标准储备液。

1.4.2 混合对照品溶液的配制。从各对照品溶液中取1mL溶液（VB2取5mL），加0.01mol/L盐酸配成浓度为50μg/mL的混合对照品溶液。按需逐级稀释成标准曲线。

1.5 供试品溶液的制备

1.5.1 维生素片。取适量样品，用粉碎机机将其研成粉末;准确称取研制好的样品0.5g至25mL棕色容量瓶中，加入0.01mol/L盐酸至近刻度线，超声20min;待样液冷却后定容至刻度即得。

1.5.2 维生素类功能饮料。准确量取0.5mL至25mL棕色容量瓶中，加入0.01mol/L盐酸至近刻度线，超声提取20min;待样液冷却后定容至刻度即得。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

根据相关水溶性维生素的理化性质[1，6-8]，经实验验证，烟酸、烟酰胺、泛酸钙、吡哆辛、吡哆醛、吡多胺、VB2在纯水中溶解良好（VB2加少许稀酸），VB1、VC在0.01mol/L的盐酸中溶解良好。

2.2 色谱条件

本实验最初计划分离12种水溶性维生素（除本方法中的10种水溶性维生素外，还包括叶酸、生物素），并成功实现12种水溶性维生素的基线分离（分离度大于1.5，如图1所示）。然而，叶酸与生物素在优化好的仪器条件下重复测定，重现性较差，这可能是由于叶酸与生物素在pH=3.1的酸性条件下不稳定所致。因此，本方法并不包含叶酸与生物素的测定。

2.2.1 色谱柱的选择。本文比较了C8柱与C18柱对水溶性维生素的分离效果，发现经过梯度优化后C8柱未能将吡多胺与VB1、叶酸与VB12等物质分离开，且VB2未能在较短时间内出峰;而C18柱分离效果良好，所以本实验选择C18柱进行分析。

2.2.2 流动相pH的选择。在实验过程中，将流动相pH调为4和6进样。当pH=4时，色谱图与pH=3时较为接近，但分离效果没有后者好;而当流动相pH为6时，部分水溶性维生素难以得到有效分离。因此，实验选择流动相pH为3.1。

2.2.3 检测波长的选择。通过PDA检测器对10种水溶性维生素在波长190～400nm进行紫外图谱扫描，综合各个维生素的最大吸收波长，选取4个检测通道进行检测。检测波长：泛酸为210nm;VB1、VC、烟酸、烟酰胺、VB2为260nm;吡哆胺、吡哆辛、吡哆醛为280nm;VB12为360nm。

2.3 提取条件的优化

2.3.1 提取方式。水溶性维生素的提取方法包括直接提取法、超声提取法[1，6]，尚未有多种水溶性维生素同时提取的研究报道。本文以某品牌维生素片剂为试样，于室温下用纯水提取20min，对比了静置提取法、超声提取法、振荡提取法等对8种水溶性维生素的提取效果（由于VB6常以吡哆辛作为有效成分添加，未找到含有吡哆胺、吡哆醛的样品）。结果如图2所示。结果表明，对于VB1、烟酰胺、VB2，超声提取法的提取率均明显高于其他两种方法;对于其他维生素，超声提取法提取率与其他两种方法极为接近。综上考虑，后续实验均选择超声提取法。

2.3.2 提取溶剂。由于水溶性维生素为强极性化合物，文献报道多采用纯水进行提取[2]，也有报道部分水溶性维生素在酸性条件下提取[3]。本文分别使用纯水、盐酸（0.01mol/L）、流动相（磷酸二氢钾溶液，磷酸调节pH=3.1），将上述试样于室温下超声提取20min，考察了不同提取溶剂对水溶性维生素提取效果的影响。结果如图3所示，结果表明，盐酸提取对烟酰胺、VB6、VB2、烟酸相对于其他两种方法提取率明显较高;而对于其他维生素，盐酸提取与其他两种溶剂提取效果相近（[RSD]<1.3%），因此后续实验均采用盐酸作为提取溶剂。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围。配制浓度为0.2～50μg/mL维生素对照品混标溶液进行分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，10种水溶性维生素的浓度在0.2～50μg/mL，呈良好线性关系，相关系数为0.999 5以上。

2.4.2 精密度。准确称取6份样品，每份样品约0.5g，按上法操作，测得各维生素[RSD]在1.11%～4.76%。

2.4.3 加标回收率。按上述条件检测10种水溶性维生素含量，测得各维生素平均回收率在92.7%～103.7%，相对标准偏差为0.11%～2.80%。

2.4.4 檢出限。将标准溶液逐级稀释，直至信噪比约为3时的浓度为仪器检出限，并根据定容体积25mL，样品称样量0.5g，换算方法检出限与定量限。结果表明，10种水溶性维生素的方法检出限为2～9mg/kg，定量限为5～30mg/kg。

2.5 实际样品测定

使用本方法测定市售保健食品中的水溶性维生素含量，并将测定结果与样品标示值及国标方法检测结果进行对比，结果见表1。结果表明，本文所建立的方法可用于保健食品中水溶性维生素的测定，测定结果与参考值基本一致;部分测定结果与国标方法检测结果有所偏差，仍需进行方法对比等进一步研究。

3 讨论

本文建立了一种高效液相色谱法同时测定10种水溶性维生素的方法。通过优化色谱柱、流动相、梯度洗脱条件等，实现了10种水溶性维生素的基线分离。对提取方法进行了研究，优化了提取方式、提取溶剂、提取温度和提取时间等。将所建立的方法进行方法学验证，结果表明，10种水溶性维生素线性范围为0.2～50μg/mL，线性系数为0.999 5～1.000 0;平均回收率在92.7%～103.7%，重复测定相对标准偏差为0.37%～2.80%（[n]=3）;10种水溶性维生素的检测限为1.5～9.0 mg/kg。所建立的方法简单、方便、快速且准确，可用于保健食品中多种水溶性维生素的同时测定。

参考文献：

[1]吴景，邢书霞，曹进.食品中维生素检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015（8）：2881-2889.

[2]陈卫伟，潘葳，雷锦桂，等.HPLC梯度洗脱法同时测定花菜中8种水溶性维生素[J].现代科学仪器，2008（3）：16-18.

[3]王浩，刘艳琴，杨红梅，等.HPLC法同时测定婴幼儿配方奶粉中5种水溶性维生素[J].中国乳品工业，2009（10）：56-58.

[4]陈美君，王旻，亢美娟，等.超高压液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中11种B族维生素[J].食品科学，2016（37）：144-153.

[5]梁瑞强，王聪，曹进，等.高效液相色谱-串联质谱法测定保健食品中10种水溶性维生素[J].食品安全质量检测学报，2016（3）：966-974.

[6]李强，李挥，庞坤，等.功能性饮料中11种水溶性维生素的高通量检测技术研究[J].河北省科学院学报，2012（3）：44-48.

[7]田颖，黄挺，刘军，等.高效液相色谱法同时测定多维元素片中9种水溶性维生素[J].分析实验室，2011（11）：52-56.

[8]Gliszczynska A， Rybicka S I. Simultaneous Determination of Caffeine and Water-Soluble[J]. Food Anal.Methods，2015（8）：139-146.