土木香总内酯致大鼠胃黏膜损伤作用及其对前胃黏膜凋亡的影响

胡又 谢颖 陈雪 王莹

摘要：目的：明确土木香总内酯灌胃对SD大鼠胃黏膜的损伤作用及其对大鼠前胃黏膜凋亡的影响。方法：选取40只SD大鼠随机分为2组，对照组用溶媒CMC-Na、给药组用土木香总内酯（120mg/kg）连续灌胃28天，用HE染色观察大鼠胃黏膜的病理改变，用TUNEL方法检测大鼠前胃黏膜的凋亡情况。结果：与对照组相比，给药组大鼠前胃黏膜过角化、鳞状上皮单纯增生与乳头状增生的发生率显著增加。在给药后发生的增生性病变中，凋亡指数随增生严重程度的增加而降低。结论：土木香总内酯能诱发大鼠前胃黏膜发生过角化与增生性病变，其机制可能是土木香总内酯通过抑制前胃鳞状上皮的凋亡导致增生的发生。

关键词：土木香总内酯;胃黏膜损伤

中图分类号：$859.7 文献标识码：A 文章编号：2096-5249（2019）04-119-003

土木香总内酯是中药土木香的有效成分，具有抗菌、驱虫、保肝等药理作用，现代有大量研究表明其通过细胞毒性作用与促凋亡活性发挥抗肿瘤疗效。尽管土木香总内酯药理作用强大，但目前土木香总内酯是否具有毒性作用，有哪些毒性病理学变化，产生毒性作用的机制如何，停药后毒性损伤是否能够恢复，以上问题均未见文献报道。本研究对SD大鼠进行了土木香总内酯灌胃28天毒理学试验，以明确土木香总内酯是否具有毒性作用，并探讨其毒性作用机制，为土木香的安全应用提供毒理学资料。

1材料与方法

1.1动物 6周龄的SPF（specific pathogen free，SPF）级SD大鼠，雌雄各半，共40只（辽宁新药安全评价中心提供）。动物饲养于辽宁新药安全评价中心屏障系统内（室温23±2℃，相对湿度40-60%，12小时明暗循环），采用标准饮食，灭菌自来水，自由摄食摄水。本研究中的动物使用情况符合国家动物福利法律法规（2006年，中华人民共和国科学部），动物福利得到IACUC（theInstitutionalAnimal CareandUse Committee）的批准。

1.2样品土木香总内酯，由辽宁新药安全评价中心提供;本品为白色至淡黄色结晶固体，含量为97.0%。临用前称量，用CMC-Na配制，现用现配。

1.3分组与给药 经环境适应性饲养1周后，将所有动物随机分为2组：对照组使用溶媒CMC-Na、给药组使用120mg/kg土木香总内酯进行灌胃，每组20只动物，雌雄各半。连续灌胃给药28天。

1.4样本采集在实验第29天处死大鼠。在麻醉后进行解剖，打开腹腔，取出全胃，沿大弯剖开，暴露胃黏膜，肉眼观察胃黏膜改变，记录病灶部位、数目、大小、形态。并将胃组织固定在10%的中性福尔马林中。

1.5病理组织学观察 将固定后的胃组织沿目的纵轴连续切成3～5mm宽的组织条块，并做成3pm的连续石蜡切片。通过HE染色（Hematoxylin and Eosin，HE）观察胃黏膜的病理变化。诊断标准参照INHAND标准。结果由一位病理专家进行病变诊断及病变程度的鉴定，后由另一位病理专家采取盲法阅片。

1.6±UNEL法检测凋亡 采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（产品编号：WLA029b，wanleibio Inc，Liaoning，China）。烤片脱蜡水化后，用PBS清洗5分钟，柠檬酸抗原修复液（MVS-0066，Maixin Inc。，Fuiian，China）中火修复5分钟，滴加过氧化氢室温孵育10分钟，PBS清洗，滴加TUNEL反应缓沖液37℃孵育60分钟，PBS清洗，滴加PID转换缓冲液37℃孵育30分钟，PBS清洗，进行DAB（Diaminobenzidine，DAB））显色。苏木素复染，分化、反蓝，脱水，透明，封片。同时制作阴性对照与阳性对照切片。TUNEL染色结果计数5个视野中的总细胞数和TUNEL阳性细胞数，以如下公式计算凋亡指数。

1.7统计分析 使用SPSS19.0统计软件，大体解剖发现和组织学所见数据使用Fisher's确切概率法，TUNEL结果使用方差分析进行统计。认为P<0.05为有显著性差异。

2实验结果

2.1大鼠前胃组织形态学观察

2.1.1大体解剖学改变 SD大鼠灌胃土木香总内酯28天后所有动物全部存活，未发现死亡。解剖后肉眼观察发现，对照組大鼠前胃黏膜呈白色，表面光滑，黏液丰富，富有光泽，黏膜皱襞走向规则，细密而均匀。土木香总内酯给药组大鼠前胃黏膜苍白增厚，失去光泽，偶可见黏膜表面糜烂溃疡。

2.1.2病理组织学改变 通过HE染色可见，对照组为正常前胃，黏膜层由4层细胞构成，基底部有一层矮柱状基底细胞，中间层为1-2层棘细胞，棘细胞层上方有一层扁平的颗粒细胞，最表面为角化层。各层细胞分布均匀，排列整齐。土木香总内酯给药组中，可观察到大鼠前胃发生过角化，鳞状上皮单纯性增生与乳头状增生。（表1、图1）

我们统计了所有大鼠前胃病变的发生率并进行比较。对照组大鼠均为正常胃黏膜，而土木香总内酯给药后中，大鼠前胃黏膜中过角化与增生性病变（包括单纯性增生和乳头状增生）的发生率显著增加（P<0.05）。（表2）

根据HE诊断结果，我们对发生在土木香总内酯诱发的鳞状上皮增生性病变中的凋亡情况进行了TUNEL检测，并分析凋亡指数。与正常胃黏膜相比，增生性病变中的TUNEL阳性细胞个数少，分布分散，尤以乳头状增生中明显（图2）。

给药期大鼠正常前胃黏膜平均AI值为23.61%;单纯性增生、乳头状增生凋亡指数与正常前胃黏膜相比具有显著差异（P<0.01）;其中乳头状增生中的凋亡指数更低。（P<0.01）（见表3、图3）。

3讨论

土木香是一味历史悠久，使用广泛的中药，在多个国家的传统医药中均有应用。在以往临床应用的记载中，偶有土木香引发呕吐的不良反应的记载，为了解该不良反应是否因土木香的主要活性成分土木香总内酯引起，我们对SD大鼠进行了土木香总内酯灌胃28天毒理学试验。

HE结果显示，应用土木香总内酯对SD大鼠灌胃28天后，给药组前胃发生了过角化、单纯性增生与乳头状增生。说明在本试验条件下，土木香总内酯对SD大鼠具有毒性作用，毒性作用的靶器官在前胃，能诱发前胃的增生性病变。

细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种形式，它是受基因控制的主动细胞死亡模式，细胞在凋亡诱导因素的刺激下，经由外源性死亡受体途径与内源性线粒体途径转导死亡信号，执行细胞凋亡。肿瘤发生的生物学基础是细胞凋亡与增殖之间平衡的失调，凋亡不足时，细胞的死亡倾向性降低，增殖速度加快，形成增生性病变甚至肿瘤。大鼠前胃肿瘤的发生，历经鳞状上皮增生一鳞状上皮乳头瘤一鳞癌几阶段。而乳头状增生比单纯性增生程度更严重，更接近鳞状上皮乳头瘤。为进一步探讨土木香总内酯致前胃黏膜损伤作用的机制，我们用TUNEL方法检测了大鼠前胃黏膜凋亡情况，结果发现在大鼠增生性病变中，凋亡指数随增生性病变严重程度的增加而降低。在鳞状上皮乳头状增生中观察到最低的凋亡指数。这一结果说明土木香总内酯可能通过抑制前目鳞状上皮的凋亡导致增生的发生。

土木香作为传统中药已有数百年的应用，但缺乏对其有效成分的毒理研究，本研究首次对土木香的主要有效成分土木香总内酯的经口毒性进行报道，并发现了毒作用靶器官及其毒性病理学改变，为土木香的安全用药提供了毒理学评价资料。