白芨试管球茎膨大培养基配方的筛选

黄颖融　黄孝风　侯利涵　陈慧晶　周树军　邹娜

摘要：【目的】篩选白芨试管球茎膨大培养基配方，为白芨的离体快繁和工业化生产提供参考依据。【方法】采用L9（34）正交试验和单因素完全随机试验设计方法，筛选适宜白芨试管球茎膨大的基本培养基、生长调节剂种类和浓度及蔗糖和活性炭浓度，确定白芨试管球茎膨大的最佳培养基配方。【结果】萘乙酸（NAA）和基本培养基对白芨试管球茎膨大的影响大于6-苄氨基嘌呤（6-BA），当NAA浓度为0.1 mg/L时，试管球茎膨大的各指标值均最大;6-BA对试管球茎膨大各指标值均无显著影响（P>0.05）;以1/2MS为基本培养基更有利于白芨试管球茎生根和膨大。蔗糖是影响白芨试管球茎膨大的重要因素，随蔗糖浓度增加，试管球茎逐渐膨大且根生长量及植株长势渐好，当蔗糖浓度为20.0～40.0 g/L时试管球茎增殖效果较佳。培养基中添加0.5 g/L活性炭的白芨试管球茎鲜重增殖率最高，为33.41%。相关性分析结果表明，试管球茎生根率与鲜重增殖率呈正相关，与高度增殖率呈显著正相关（P<0.05）;试管球茎萌芽率与鲜重增殖率、高度增殖率和直径增殖率均呈负相关，即生根对试管球茎膨大起促进作用，而芽分化对试管球茎膨大起抑制效应。【结论】1/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+20.0 g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭可作为白芨试管球茎膨大的最佳培养基配方加以推广应用。

关键词： 白芨;试管球茎;膨大;离体快繁;培养基配方

中图分类号： S682.31                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）05-1064-08

Aabstract：【Objective】In order to provide reference for in vitro rapid propagation and industrial production of Bleti-lla striata，the medium formulation of bulbous enlargement was screened. 【Method】The suitable basic medium，different plant growth regulators，concentrations of sucrose and activated carbon on B. striata bulbous enlargement were studied utilizing L9（34） orthogonal experiment and single-factor complete random experiment design methods to screen the best medium formulation for bulbous enlargement of B. striata in vitro. 【Result】The results showed that the effects of nafusaku（NAA） and basal medium on bulbous enlargement was greater than that of 6-benzylaminopurine（6-BA）. When NAA concentration was 0.1 mg/L，the average value of each index of bulb enlargement was the largest. 6-BA had no significant effect on each index of bulbous enlargement（P>0.05）. 1/2MS was beneficial to the rooting and bulbous enlargement of B. striata. Sucrose was an important factor affecting the bulbous enlargement of B. striata in vitro. With the increase of sucrose content，the bulb gradually expanded， the roots and plant growth were fine. The bulb proliferation of B. striata was fine when sucrose concentration was 20.0-40.0 g/L. The fresh weight proliferation rate was the highest（33.41%） with 0.5 g/L activated carbon adding into basal medium. Correlation analysis showed that the rooting rate was positively correlated with fresh weight gain rate， and was significantly positively correlated with height multiplication rate（P<0.05）. Germination rate was negatively correlated with fresh weight gain rate，height multiplication rate and diameter multiplication rate. It indicated that rooting promoted bulbous enlargement and the bud differentiation inhibited bulb enlargement. 【Conclusion】The suitable medium formulation for the bulbous enlargement of B. striata is 1/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+20.0 g/L sucrose+0.5 g/L activated carbon and can be promoted in production.

Key words： Bletilla striata; bulb in tube; enlargement; in vitro rapid propagation; medium formulation

0 引言

【研究意义】白芨（Bletilla striata）为兰科白芨属多年生草本植物，其花大且色艳，集观赏和药用价值于一体（石晶，2010）。由于野生白芨资源遭到过度采挖，加上白芨种子在自然条件下繁殖困难，其野生资源已急剧减少，因此白芨已被我国列为珍稀濒危保护植物（陆峻波等，2011）。至今，有关白芨属植物的研究报道主要集中于组织培养与快繁技术（管常东等，2010;邹娜等，2013）、栽培技术（张满常等，2015;陈润泽，2018）和药理与临床（王晓等，2017;胡长玉等，2018）等方面，也有部分针对资源与利用（石晶，2010）、细胞悬浮体系建立（刘军凯，2012）和胁迫响应（王莹博等，2018）的报道。白芨的繁殖以分生繁殖为主，但分生系数小，植株生长周期较长，且耗种量大，不宜进行大规模商业化生产（张亦诚，2007）。组织培养技术具有繁殖系数高、受外界环境条件限制小等特点，可在短期内获得大量材料实现规模化生产（李浩川等，2018;饶宝蓉等，2018;宋刚等，2018）。在白芨的常规组织培养过程中，试管苗的球茎重量轻、直径小，移栽后地上部容易枯萎、成活率低，移栽后第2年大多数未能达到商业生产标准，而用试管球茎替代试管苗进行移栽，因试管球茎贮藏的养分能为幼苗生长发育提供大量营养，可有效解决移栽后试管苗成活率低的问题（刘旭忻等，2015），但目前有关白芨试管球茎膨大培养基配方筛选的研究尚无报道。因此，筛选白芨试管球茎膨大培养基配方，对其种苗的离体快繁和工业化生产具有重要意义。【前人研究进展】Varshney等（2000）、朱锦等（2002）、王光萍等（2005）研究发现，蔗糖是培养基中的碳源，能为植物提供营养物质，具有促进植物生长的作用，尤其较高浓度的蔗糖能刺激百合和石蒜鳞茎形成和膨大。张延龙等（2006）、张洁等（2010）、张艳波（2013）研究认为，用于诱导百合试管鳞茎形成及膨大的培养基主要为MS，但培养基中不同浓度的大量元素也会对鳞茎的形成和膨大产生影响。建立于试管苗培育基础上的试管鲜茎膨大技术目前已在百合和石蒜等植物的相关研究中取得了一定成果（张延龙等，2006;任亚萍等，2011;张彦妮等，2016;刘旭忻等，2018）。苏菁华（2014）研究显示，培养基中6-苄氨基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）浓度均为0.5 mg/L时渥丹和川百合小鳞茎的膨大效果最佳。此外，在培养基中添加适宜浓度的活性炭，对百合鳞茎发育也有一定效果（胡凤荣等，2006;王晓丽等，2011;秦新惠等，2015）。【本研究切入点】已有研究表明，3种纳金花属植物及乳白石蒜和中国石蒜等试管鳞茎移栽后，其成活率与试管鳞茎大小直接相关，试管苗形成的鳞茎越大其移栽成活率越高（杨曦，2013），但至今未见关于白芨试管球茎膨大培养基配方筛选及用膨大试管球茎替代试管苗移栽的相关研究报道。【拟解决的关键问题】分析植物生长调节剂种类（NAA和6-BA）和浓度配比、基本培养基及蔗糖和活性炭浓度对白芨试管球茎膨大的影响，探索促使白芨试管球茎膨大的途径，筛选出最适白芨试管球茎膨大的培养基配方，进而用膨大的试管球茎替代试管苗进行移栽，为白芨的离体快繁、育种和工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验于2017年10月22日—2018年3月12日在江西农业大学花卉基地组培室进行，以其继代保存的白芨无菌试管苗开展球茎膨大试验。生长调节剂NAA和6-BA购自上海蓝季科技发展有限公司;基本培养基购自荷兰哈勒姆（Duchefa Biochemie，Haarlem，The Netherlands）;蔗糖和活性炭等购自天津市大茂化学试剂厂。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 小球茎获得 将白芨不定芽分割成单芽，转接至生根培养基1/2MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L GA3中进行生根壮苗及结球培养。40 d后取與球茎大小相近的试管苗，切去其叶片和根系，将球茎接种于各膨大培养基中。

1. 2. 2 试管球茎膨大L9（34）正交设计 试验采用3因素（生长素、细胞分裂素和基本培养基）3水平（生长素的3个浓度、细胞分裂素的3个浓度和基本培养基的3种类型）进行L9（34）正交设计（表1），共9个处理组合，筛选适宜白芨试管球茎膨大的培养基配方。

1. 2. 3 蔗糖浓度筛选 在正交试验得出白芨试管球茎膨大培养基配方的基础上，采用单因素完全随机试验设计方法，分析培养基中蔗糖浓度（0、20.0、40.0、80.0和120.0 g/L）对白芨试管球茎膨大指标的影响。

1. 2. 4 活性炭浓度筛选 以正交试验结果和适宜蔗糖浓度为基础，采用单因素完全随机试验设计方法，分析培养基中活性炭浓度（0、0.5、1.0和2.0 g/L）对白芨试管球茎膨大指标的影响。

1. 2. 5 培养条件、测定指标及方法 在1.2.1～1.2.4中，培养室温度（25±2）℃，光照时间12 h/d，光照强度2000 lx。如无特殊说明，所有培养基均添加植物凝胶3.0 g/L和蔗糖20.0 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃高压灭菌20 min。接种45 d后，统计各处理生根率、萌芽率和分化芽数，然后从培养基中取出球茎，剪去叶片和根，称其鲜重，测定球茎直径和高度，统计球茎的膨大指标（鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率）等。每处理接种6瓶，3次重复。

生根率（%）=生根球茎数/接种球茎总数×100

萌芽率（%）=萌芽球茎数/接种球茎总数×100

分化芽数=分化出的不定芽总数/接种球茎总数

鲜重增殖率（%）=（试验结束时球茎鲜重-球茎

初始鲜重）/球茎初始鲜重×100

直径增殖率（%）=（试验结束时球茎直径-球茎

初始直径）/球茎初始直径×100

高度增殖率（%）=（试验结束时球茎高度-球茎

初始高度）/球茎初始高度×100

1. 4 统计分析

采用DPS 7.05进行正交试验设计，试验数据采用Excel 2016进行整理，以SPSS 17.0进行单因素方差分析和Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2. 1 植物生长调节剂种类及基本培养基配比对白芨试管球茎膨大的影响

表2为植物生长调节剂和基本培养基对白芨试管球茎膨大影响的正交试验结果，图1-A为各处理白芨试管球茎的膨大效果，图1-B为处理2试管球茎的生长状态。从图1-A可看出，白芨的试管球茎近球形，略不规则，其膨大效果主要在鲜重增殖上体现，其次是在直径增殖和高度增殖上体现。极差分析结果（表3）表明，NAA、6-BA和基本培养基对白芨试管球茎鲜重增殖率的极差（RA）分别为26.23、6.37和22.54，经调整后的极差（R'A）分别为23.62、5.73和20.30，即影响白芨试管球茎鲜重增殖率的试验因素排序为NAA>基本培养基>6-BA。NAA、6-BA和基本培养基对白芨试管球茎直径增殖率的极差（RB）分别为6.61、2.52和7.78，调整后的极差（R'B）分别为5.95、2.27和7.01;对白芨试管球茎高度增殖率的极差（RC）分别为3.00、1.70和4.88，调整后的极差（R'C）分别为2.71、1.53和4.40，即影响直径增殖率和高度增殖率的试验因素排序均为基本培养基>NAA>6-BA。说明影响白芨试管球茎膨大的主要因素是NAA和基本培养基，6-BA的影响较小。其中，当基本培养基中NAA浓度为0.1 mg/L时，白芨试管球茎膨大各指标的增殖率均最高，鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率分别为44.77%、12.99%和8.24%，较NAA浓度为0.5和1.0 mg/L的培养基分别提高141.48%和23.37%、103.61%和7.98%、57.25%和36.88%;当基本培养基为1/2MS时，白芨试管球茎的鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率均最高，较以MS和2MS为基本培养基分别提高5.10%和119.69%、24.29%和125.69%、103.83%和83.17%;6-BA对白芨试管球茎膨大各指标的增殖率影响均较小，但以浓度1.0 mg/L时的鲜重增殖率最高。

方差分析结果（表4）表明，NAA对白芨试管球茎鲜重增殖率和直径增殖率的影响分别达极显著水平（P<0.01，下同）和显著水平（P<0.05，下同），对高度增殖率的影响不显著（P>0.05，下同）;基本培养基对鲜重增殖率和高度增殖率的影响均达显著水平，对直径增殖率的影响达极显著水平;而6-BA对各指标的影响均未达显著水平。综上所述，白芨试管球茎膨大的最佳培养基配方为1/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。

2. 2 培養基中蔗糖浓度对白芨试管球茎膨大的影响

图1-C为不同浓度蔗糖处理的白芨试管球茎膨大效果，图1-D为40.0 g/L蔗糖处理的白芨试管球茎生长状态。由表5可知，白芨试管球茎的鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率均随培养基中蔗糖浓度的增加呈先增加后减少的变化趋势，且均在蔗糖浓度为20.0和40.0 g/L时达较大值。试管球茎鲜重增殖率和直径增殖率在基本培养基中蔗糖浓度为0～80.0 g/L时差异不显著，高度增殖率以蔗糖浓度为20.0 g/L时最高，极显著高于不添加蔗糖和添加蔗糖浓度为80.0和120.0 g/L时的高度增殖率，但与蔗糖浓度40.0 g/L的高度增殖率差异不显著。综合考虑其经济成本，白芨试管球茎膨大培养基中蔗糖浓度以20.0 g/L为宜。

2. 3 培养基中活性炭浓度对白芨试管球茎膨大的影响

图1-E为不同浓度活性碳处理的白芨试管球茎膨大效果，图1-F为0.5 g/L活性碳处理的白芨试管球茎生长状态。由表6可知，白芨试管球茎的鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率均随培养基中活性炭浓度的增加呈先增加后减小的变化趋势，当活性炭浓度为0.5 g/L时达最大值，分别较不添加活性炭提高51.86%、1.76%和42.28%，但无显著差异;培养基中活性炭浓度为0.5 g/L时试管球茎的鲜重增殖率和高度增殖率极显著或显著高于活性炭浓度为1.0和2.0 g/L时的鲜重增殖率和高度增殖率;不同活性炭浓度培养基中白芨试管球茎的直径增殖率间无显著差异，但活性炭浓度为1.0 g/L时的试管球茎直径增殖率明显低于活性炭浓度为0.5 g/L时的直径增殖率。培养基中活性炭浓度为1.0和2.0 g/L时的试管球茎鲜重增殖率与不添加活性炭时的试管球茎鲜重增殖率无显著差异。因此，白芨试管球茎膨大培养基中活性炭添加量以0.5 g/L为宜，在实际生产中也可考虑不添加活性炭。

2. 4 白芨试管苗生长与球茎膨大间的相关性

对表2、表5和表6中白芨试管球茎生根萌芽率和膨大指标增殖率数据进行相关性分析，结果（表7）表明，白芨试管球茎鲜重增殖率与直径增殖率和高度增殖率、直径增殖率与高度增殖率呈极显著正相关;试管球茎生根率与鲜重增殖率呈正相关，与高度增殖率呈显著正相关，与直径增殖率呈负相关;试管球茎萌芽率与鲜重增殖率、高度增殖率和直径增殖率呈负相关，其中与直径增殖率呈显著负相关。说明生根对试管球茎膨大起促进作用，而芽分化对试管球茎膨大起抑制效应。

3 讨论

3. 1 关于植物生长调节物质及基本培养基对白芨试管球茎膨大的影响

离体培养条件下，在培养基中添加适宜浓度及比例的生长素和细胞分裂素有利于植物储贮藏器官发育。本研究结果表明，较低浓度（0.1 mg/L）NAA可促进白芨试管球茎膨大，与Lim等（1998）对东方百合杂交系品种Casa blanca和Acapulco的研究结果相似。本研究中，6-BA对白芨试管球茎膨大影响不显著，可能与细胞分裂素的主要生理作用是诱导芽细胞分裂和分化、促进侧芽萌发生长等有关（Kamínek et al.，2010）。李慧敏等（2013）研究表明，6-BA和激动素（KT）是影响白芨假鳞茎形成和膨大的主要因素，NAA对平均粒径即假鳞茎的生长与膨大无明显影响。本研究发现6-BA对白芨试管球茎膨大影响较小，而NAA是影响白芨试管球茎膨大的主要因素，与李慧敏等（2013）的研究结果存在差异，可能是白芨试管球茎所处生长阶段存在差异所引起，说明不同生长阶段白芨试管球茎对植物生长调节剂种类的需求不同。

已有研究表明，调整培养基中NAA与6-BA的比例可调控无菌苗根和芽的分化（葛军等，2004;田士林和李莉，2007），本研究结果与其相似，并发现白芨试管球茎根和芽的分化影响白芨试管球茎的膨大;培养基中NAA浓度为0.1、0.5和1.0 mg/L时白芨试管球茎的鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率均得以提高，但NAA浓度为0.5 mg/L时的鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率均低于其他2个浓度，可能与培养基中NAA与6-BA的浓度配比不同有关。

基本培养基是影响白芨试管球茎生根、芽分化和促进试管球茎膨大的重要因素。本研究结果表明，当基本培养基为1/2MS时，白芨试管球茎的膨大效果最好，与张延龙等（2006）、张洁等（2010）、张艳波（2013）研究认为浓度过低（1/2MS）的大量元素对大多数百合试管鳞茎膨大有不良影响、高浓度（2MS和3MS）可促进试管鳞茎膨大的观点不一致，可能与不同植物种类或变态器官类型对营养物质的需求量存在差异有关。

3. 2 关于蔗糖浓度对白芨试管球茎膨大的影响

糖类作为培养基的主要成分之一，可调节植物形态的发生和生理过程（郭亚芬，2011;Horacio and  Martinez-Noel，2013;邹竣竹等，2017）。本研究结果表明，白芨试管球茎的鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率随培养基中蔗糖浓度的增加呈先增加后减少的变化趋势，与孙静秋等（2003）研究认为添加高质量浓度蔗糖会改变培养基中渗透压，影响植株的正常生长，使多糖物质合成和储藏受阻，影响球根的形成和生长的观点一致。但也有研究表明，高质量浓度蔗糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的作用与其产生的渗透胁迫无关，可能是由于高质量浓度蔗糖会引起鳞茎内源性糖含量及相关酶活性发生变化（Partelli et al.，2010;Turhan and Ergin，2012;周玲云等，2016）。

3. 3 关于活性炭浓度对白芨试管球茎膨大的影响

本研究结果表明，在培养基中添加适量活性炭能促进白芨试管球茎膨大，其中以添加0.5 g/L时的促进效果最佳，与王晓丽等（2011）、秦新惠等（2015）对垂花百合和兰州百合的研究结果相似。活性炭除可为组培苗生根培养创造黑暗环境外，还具有吸附培养基中杂质的作用，但在一定程度上也会吸附培养基中的营养物质（谢杰等，2006），因此添加量过大不利于植物生长。本研究培养基中的活性炭浓度为1.0 g/L時白芨试管球茎的鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率均明显受到抑制，一方面可能是由于较高浓度的活性炭会吸附培养基中的营养物质，致使促进白芨生长的营养物质含量降低;另一方面可能是培养基中添加1.0 g/L活性炭的白芨试管球茎萌芽较早，而此时根系尚未发育，无法向试管球茎提供养分，试管球茎萌芽只能消耗试管球茎的营养从而抑制试管球茎增殖膨大。

3. 4 关于白芨试管苗生长与球茎膨大的相关性

相关性分析结果表明，白芨试管球茎鲜重增殖率与直径增殖率和高度增殖率、直径增殖率与高度增殖率呈极显著正相关;试管球茎生根率与鲜重增殖率呈正相关，与高度增殖率呈显著正相关，与直径增殖率呈负相关;试管球茎萌芽率与鲜重增殖率、高度增殖率和直径增殖率均呈负相关，即白芨试管球茎生根对试管球茎膨大产生促进作用，而芽分化对试管球茎膨大产生抑制效应。因此推测，本研究中白芨试管球茎膨大对不同试验因素的响应与试管球茎根系诱导有关，通过形成根系从而促进白芨试管球茎对营养物质的吸收并增殖膨大。

4 结论

1/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+20.0 g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭可作为白芨试管球茎膨大的最佳培养基配方加以推广应用。

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（責任编辑 思利华）