荆芥与连翘混合挥发油提取工艺优化

李佳佳 郑鹏 顿佳颖 高亚玲 甄丽娜 李春花

摘 要 目的：建立同时测定荆芥与连翘混合挥发油中β-蒎烯、胡薄荷酮含量的方法，并优化其混合挥发油提取工艺。方法：采用气相色谱法测定β-蒎烯、胡薄荷酮的含量，色谱柱为Hp-5毛细管色谱柱，检测器为氢火焰离子检测器，程序升温，进样量为0.5 μL，分流比为70 ∶ 1，载气为氮气，进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃，空气流速为390 mL/min，氢气流速为36 mL/min，尾吹流速为15 mL/min，氮气流速为1 mL/min。采用水蒸气蒸馏法提取混合挥发油，以浸泡时间、提取时间、加水量、连翘粉碎粒度为考察因素，以挥发油提取量、β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量及其综合评分为指标，采用正交试验设计法结合信息熵法优化混合挥发油的提取工艺。结果：β-蒎烯、胡薄荷酮检测進样量线性范围分别为1.575～7.875 μg（r=0.999 9）、1.892～9.46 μg（r=0.999 7）；定量限分别为0.10、0.25 μg，检测限分别为0.03、0.08 μg；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%（n=6）；加样回收率分别为97.77%～100.01%（RSD=0.93%，n=9）、96.47%～99.00%（RSD=0.89%，n=9）。优化的提取工艺为浸泡2 h、提取6 h、加入10倍量水（mL/g）、连翘粒度半瓣。在此条件下，挥发油提取量、β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量分别为 3.6 mL、1 450.4 mg、127.6 mg，RSD分别为1.62%、0.20%、1.42%。结论：所建含量测定方法简单、准确，重复性好，优化所得提取工艺稳定、可行。

关键词 荆芥；连翘；混合挥发油；水蒸气蒸馏法；正交试验；信息熵法；气相色谱法；β-蒎烯；胡薄荷酮

Optimization of the Extraction Technology of Volatile Oil from Schizonepeta tenuifolia and Forsythia suspensa

LI Jiajia1，ZHENG Peng1，DUN Jiaying1，GAO Yaling2，ZHEN Lina3，LI Chunhua1（1. College of Pharmacy， Hebei College of TCM， Shijiazhuang 050200， China； 2. Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational and Technical College， Shijiazhuang 050026， China； 3. Dept. of Oncology， Hebei Provincial People’s Hospital， Shijiazhuang 050057， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of volatile oil of Schizonepeta tenuifolia and Forsythia suspensa， and to optimize the extraction technology of the volatile oil. METHODS： The contents of β-pinene and pulegone were determined by GC method. The determination was performed on Hp-5 capillary column. The detector was hydrogen flame ion detector with programmed temperature. The sample size was 0.5 μL， the split ratio was 70 ∶ 1， the carrier gas was nitrogen， the inlet temperature was 250 ℃， the detector temperature was 280 ℃， the air flow rate was 390 mL/min， the hydrogen flow rate was 36 mL/min， the tail flow rate was 15 mL/min， and the nitrogen flow rate was 1 mL/min. Based on single factor test， orthogonal test combined with information entropy method were used to optimize the extraction technology of S. tenuifolia and F. suspensa using soaking time， extraction time， material-liquid ratio and forsythia grain size as factors， with the extraction amount of volatile oil， the content of β-pinene and pulegone and their comprehensive score as indexes. RESULTS： The linear range of β-pinene and pulegone 1.575-7.875（r=0.999 9） and 1.892-9.46 μg（r=0.999 7）， respectively. The limits of quantitation were 0.10 and 0.25 μg； the limits of detection were 0.03 and 0.08 μg； RSDs of precision， stability and reproducibility tests were less than 2% （n=6）； the recoveries were 97.77%-100.01% （RSD=0.93%，n=9） and 96.47%-99.00%（RSD=0.89%， n=9）. The optimal extraction technology was soaking 2 h， extracting for 6 h， 10-fold water （mL/g）， half a clove of granularity. Under this condition， the extraction amount of volatile oil， the contents of β-pinene and pulegone were 3.6 mL， 1 450.4 mg， 127.6 mg， respectively. RSD were 1.62%， 0.20%， 1.42%. CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate and reproducible， and the optimal extraction technology is stable and feasible.

KEYWORDS Schizonepeta tenuifolia； Forsythia suspensa； Volatile oil； Steam distillation； Orthogonal test； Information entropy method； GC； β-pinene； Pulegone

羚羊感冒片是一种包衣片剂，具有清热解毒之功效，对流行性感冒的治疗具有显著疗效。该药由羚羊角、牛蒡子、淡豆豉、金银花、荆芥、连翘、淡竹叶、桔梗、薄荷素油、甘草等10味中药材组成，其中荆芥与连翘的混合挥发油是其的主要药效成分。现代药理研究證实，荆芥挥发油为“辛”味成分，能行能散，上达皮肤表层，增强皮肤血液循环，增加汗腺分泌，有解热作用[1-2]；连翘挥发油具有较强的抗炎、止痛作用[3]。胡薄荷酮为荆芥挥发油的主要成分，β-蒎烯为连翘挥发油的主要成分，因此两者的含量可作为荆芥与连翘的混合挥发油质量控制的主要指标[4-5]。

目前，对荆芥、连翘单味药挥发油提取的研究已有报道[6-9]，常用连翘挥发油的提取方法为水蒸气蒸馏法和超临界CO2萃取法，荆芥挥发油的提取方法为水蒸气蒸馏法和微波辅助提取法，但尚未有荆芥与连翘混合挥发油提取工艺的文献报道。为此，本研究参考上述文献采用水蒸气蒸馏法提取荆芥与连翘的混合挥发油，并对其提取工艺进行优化；同时建立了采用气相色谱法测定荆芥与连翘混合挥发油的含量，旨在为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

7890B型气相色谱仪，包括SPH-300型氢气发生器、SPB-3型全自动空气源（美国Agilent公司）；TD5A-WS台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；BSM1204型分析天平（上海卓精仪器有限公司）；LQ-A10002型电子天平（上海乐祺医疗器械有限公司）。

1.2 试剂

β-蒎烯对照品（批号：YN0418SA14，纯度：99%）、胡薄荷酮对照品（批号：Z18D6H7858，纯度：98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂），无水硫酸钠（分析纯，深圳市中发源生物科技有限公司），无水乙醇（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司），水为超纯水。

1.3 药材

荆芥饮片（批号：18031801）、连翘饮片（批号：18022302）均购于河北省保定市安国市场，经河北中医学院药学院侯芳洁副教授鉴定分别为唇形科植物荆芥（Schizonepeta tenuifolia Briq.）的干燥地上部分、木犀科（Oleaceae）植物连翘[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果实。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 气谱条件 色谱柱：Hp-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；检测器：氢火焰离子检测器；程序升温（升温程序见表1）；进样量：0.5 μL；分流比：70 ∶ 1；载气：氮气；进样口温度：250 ℃；检测器温度：280 ℃；空气流速：390 mL/min；氢气流速：36 mL/min；尾吹流速：15 mL/min；氮气流速：1 mL/min。

表1 升温程序

Tab 1 Temperature programming

[温度，℃＼&升温速率，℃/min＼&保持时间，min＼& 80＼& 0＼&2＼&100＼& 2＼&0＼&200＼& 4＼&0＼&250＼&10＼&0＼&]

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取β-蒎烯对照品15.75 mg、胡薄荷酮对照品18.92 mg，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得β-蒎烯、胡薄荷酮质量浓度分别为3.15、3.784 mg/mL的单一对照品溶液。精密吸取上述各单一对照品溶液1 mL，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 采用2015年版《中国药典》（四部）通则2204“水蒸气蒸馏法甲法”提取挥发油[10]：精密称取荆芥82 g、连翘164 g，置于3 000 mL圆底烧瓶中，加水1 968 mL，浸泡2 h，使用电热套加热4 h，提取荆芥与连翘的混合挥发油。收集混合挥发油，加无水硫酸钠干燥，以3 000 r/min离心6 min，即得混合挥发油。取上述混合挥发油1.5 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.1.4 阴性样品溶液 按 “2.1.3”项下方法分别制备缺荆芥、连翘的单一阴性样品溶液。

2.1.5 系统适用性试验 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液、“2.1.3”项下供试品溶液、“2.1.4”项下阴性样品溶液各适量，按“2.1.1”项下气谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，理论板数以β-蒎烯峰计均大于3 000，分离度均大于1.5，拖尾因子（T）=0.98（0.95

2.1.6 线性关系考察 取“2.1.2”项下各单一对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL，按“2.1.1”项下气谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得β-蒎烯回归方程为y=165 527.994 8x+70.969 0（r=0.999 9）、胡薄荷酮回归方程为y=125 366.832 6x+37.119 5（r=0.999 7）。结果表明，β-蒎烯、胡薄荷酮进样量线性范围分别为1.575～7.875 、1.892～9.46 μg。

2.1.7 定量限与检测限考察 取“2.1.2”项下各单一对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1.1”项下气谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，β-蒎烯、胡薄荷酮的定量限分别为0.10、0.25 μg，检测限分别为0.03 、0.08 μg。

2.1.8 精密度试验 取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.1.1”项下气谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，β-蒎烯、胡薄荷酮峰面积的RSD分别为0.51%、1.19%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.9 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10 h时按“2.1.1”项下气谱条件进样测定，记录峰面积。结果，β-蒎烯、胡薄荷酮峰面积的RSD分别为1.93%、1.55%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置10 h内基本稳定。

2.1.10 重复性试验 取药材样品适量，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下气谱条件进样测定，记录峰面积。结果，β-蒎烯、胡薄荷酮的平均含量分别为542.15、40.08 mg，RSD分别为1.84%、1.79%（n=6），表明本方法重复性较好。

2.1.11 加样回收率试验 按处方组成取已知含量的药材样品，共9份，分别加入一定量的单一对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下气谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.1.12 样品含量测定 取药材样品适量，共9份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下气谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，β-蒎烯含量范围为762.7～1 430.3 mg，胡薄荷酮含量范围为51.3～123.7 mg。

2.2 混合挥发油提取工艺优化

2.2.1 试验设计与结果 通过查阅相关文献[10-12]，确定以浸泡时间（A）、提取时间（B）、加水量（C）、连翘粉碎粒度（D）为考察因素，以挥发油提取量、β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量为指标，优化提取工艺；每个因素取3个不同水平，采用L9（34）正交试验设计进行试验，并结合信息熵法确定各指标的权重系数。因素与水平见表3，试验设计与结果见表4。

2.2.2 信息熵法对数据的分析 参考相关文献[13-14]方法对数据进行分析，建立原始评价指标矩阵（Xij）mn和概率矩阵（Pij）mn（i指表4中的3个指标，j指表4中的试验号，m指下列序列中的行数，n指下列序列中的列数）。

按以下公式计算各评价指标信息熵（Hi），得到各评价指标的Hi：

Hi=-[[∑][i=1][n]PijInPij

Inn] Hi=[0.994 2 0.992 2 0.986 9]

再计算各指标的权重系数（Wi）：Wi=[1-Hi

[∑][i=1][m]（1-Hi）] Wi=[0.218 6 0.291 1 0.490 4]，得挥发油提取量、β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量的权重系数分别为0.218 6、0.291 1、0.490 4。

对概率矩阵的数据进行加权处理，得到综合评分（综合评分=Xi挥发油提取量/Xmax挥发油提取量×0.218 6+Xiβ-蒎烯含量/Xmaxβ-蒎烯含量×0.291 1+Xi胡薄荷酮含量/Xmax胡薄荷酮含量×0.490 4），再进行方差分析，综合评分结果见表4，方差分析结果见表5。

表5 方差分析结果

Tab 5 Variance analysis results

[误差来源＼&A＼&B＼&C＼&D＼&离均差平方和＼&0.05 ＼&0.08 ＼&0.04 ＼&0.00 ＼&自由度＼&2.00 ＼&2.00 ＼&2.00 ＼&2.00 ＼&均方差＼&0.03 ＼&0.04 ＼&0.02 ＼&0.00 ＼&F＼&29.20 ＼&48.65 ＼&25.80 ＼&1.00 ＼&P＼&<0.05＼&<0.05＼&<0.05＼&＼&]

注：F0.01（1，2）=99；F0.05（1，2）=19

Note：F0.01（1，2）=99；F0.05（1，2）=19

由方差分析结果可知，各因素对挥发油提取量、 β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量影响大小顺序为B>A>C>D，即提取时间>浸泡时间>加水量>连翘粉碎度；A、B、C对提取工艺均有显著性差异，其中提取时间为最主要影响因素，得到最优提取工艺为A2B2C3D3，即浸泡2 h、提取6 h、加入10 倍量水（mL/g）、连翘粒度半瓣。

2.3 验证试验

按上述优化后的提取工艺，平行操作3次，得挥发油提取量、β-蒎烯含量和胡薄荷酮含量分别为3.6 mL、1 450.4 mg、127.6 mg，RSD分别为1.62%、0.20%、1.42%，提示优化所得提取工艺稳定、可行。

3 讨论

笔者查阅相关文献[15-16]，将进样口温度确定为250 ℃，检测器温度确定为280 ℃，又根据β-蒎烯与胡薄荷酮的性質，将升温范围确定为80～250 ℃。分流比可直接影响样品的检测情况，由于气相色谱柱较细，样品汽化后不可能瞬间全部进入色谱柱，需要时间太长，此外色谱带中色谱峰较宽，需要及时分流部分样品，若分流比过小，进入色谱柱的样品量多，组分间不易分离，峰形不好；分流比过大，进入色谱柱的样品量太少，灵敏度较差，故选择分流比为70 ∶ 1。

羚羊感冒片组方中荆芥、连翘的挥发油成分具有较强的解表作用，为主要药效成分。经预试验发现，荆芥与连翘的挥发油均为轻油，通过混合提取挥发油，不仅可以节省大量的时间与人力劳动，还可以使二者的挥发油很好地融合，有利于下一步的制剂操作，因此本研究按处方比例以荆芥 ∶ 连翘=1 ∶ 2提取混合挥发油，以满足实际生产的要求。

关于连翘挥发油的提取，已有较多文献报道[2，9-10]，但均未对连翘的粒度进行筛选。为提高挥发油提取量，本研究将连翘粒度分为过10目筛、半瓣及全粒3个等级，结果，连翘粒度为半瓣时提取的挥发油提取量最高，且出油速度较快。分析其原因可能为：药材有效成分的溶出分为渗透和扩散两个阶段；当药材粒度较小时，溶剂更容易渗入药材颗粒内部而加快有效成分的溶出；药物粒度的大小会影响其有效成分扩散的快慢，药材粒度较小，扩散面积增大、扩散距离缩短，有利于有效成分的扩散[17]。因此，粉碎后的连翘较未粉碎时，出油速度有所提升。但药材粉碎过细，大量细胞破裂，细胞内一些高分子物质溶于浸出液内，导致浸出杂质增多，溶液黏度增大，加之粉碎时间的增加，使粉碎机内温度升高，而致挥发油在粉碎过程中损失，故连翘粒度为过10目筛时挥发油提取量较低。

综上所述，所建含量测定方法简单、准确，重复性好，优化所得提取工艺稳定、可行。

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（收稿日期：2018-05-14 修回日期：2018-12-26）

（编辑：陈 宏）