RIPK3抑制对锰致大鼠脑星形胶质细胞活化及多巴胺能神经元障碍的影响

何莲瑜 刘丹丹 郭忠信 刘胜生 莫伟坚 邓祥发

摘要：目的：研究RIPK3抑制剂GSK’872对锰致大鼠脑星形胶质细胞活化及多巴胺能神经元障碍的影响方法：将32只SD大鼠随机分为对照组、GSK’872对照组、锰中毒组、GSK'872干预组，每组8只。采用腹腔注射法对锰中毒组及GSK'872干预组的动物染锰，建立亚急性锰中毒模型，同时干预组给予小脑延髓池注射GSK’872。动物取材时取海马及黑质组织，采用Western blot和RT-qPCR法检测GFAP及TH蛋白表达及RIP3基因表达的变化。结果：与对照组比较，GFAP的蛋白表达量明显升高;黑质TH蛋白表达量降低; RIP3基因的表达明显升高（P<0.05）;与锰中毒组比较，GSK’872干预组GFAP蛋白表达量明显下降，黑质TH蛋白表达升高;RIP3基因的表达明显降低（P<0.05）。结论：GSK’872干预可降低染锰大鼠脑内星形胶质细胞早期激活以及改善黑质多巴胺能神经细胞的功能障碍，其机制可能与GSK’872能抑制神经组织细胞坏死样凋亡的发生有关。

前言

锰（Mn）是维持生理过程所必需的微量元素之一，但中枢神经系统（CNS）中锰的过度沉积可导致神经异常，产生多种类似于帕金森病（PD）的精神、认知和运动障碍的中毒症状[1]。己知锰中毒时星形胶质细胞通过反应性增生和神经炎症促进周围组织的血运重建，对CNS的变化具有适应性保护作用，但过度的活化可引发神经递质的兴奋性毒性、增强组织的氧化应激及过度的炎症反应等损害作用[2]。当过量的锰通过血脑屏障进入CNS时，脑内的锰优先沉积在星形胶质细胞（Astrocyte，AS）中，尤其在细胞的线粒体内，胞液中锰的整体浓度比神经元高出50-60倍[3]，因此AS是锰神经毒性的初始靶细胞[3]。已知锰中毒可同时诱发神经组织细胞发生凋亡和坏死 [4]。近二十年研究不断证实细胞坏死的发生在许多条件下也存在着程序性调控的机制，包括Necroptosis（坏死性凋亡），pyroptosis（细胞焦亡）、ferroptosis、Netosis（细胞铁坏死）等调节性坏死的亚类相继被发现和论证[5]。RIP3已然被确认为调节依赖于RIP1介导的细胞死亡在凋亡与坏死间发生转换的关键因子[6]。相继发现的RIP1和RIP3的特异性抑制剂、包括Necrostatin-1、GSK'843和GSK'872[7]等为研究Necroptosis的相关机制提供了有效而关键的分子工具。

在早前的实验中我们观察到：锰暴露可诱导大鼠海马、黑质等脑区神经细胞发生凋亡和坏死，星形胶质细胞明显活化[8]。RIP1特异性抑制剂Necrostatin-1可以降低体外培养染锰多巴胺能SK-N-SH细胞的坏死率、提高其存活度[9]，提示Necroptosis的调节机制可能参与了锰的神经毒性。本研究拟通过大鼠体内实验，应用RIP3的特异性抑制剂GSK'872干预锰致大鼠脑早期星形胶质细胞活化及多巴胺能神经元障碍的影响，进一步阐述锰诱导神经组织细胞发生坏死的分子机制，并探讨通过抑制细胞坏死发生来拮抗锰暴露对CNS的损伤作用的可行性。

1、材料与方法

1.1主要试剂与仪器MnCl2·4H2O（天津市博迪化工有限公司）;GSK'872（TargetMol，美国）;兔抗大鼠GFAP、β-actin单克隆抗体和二抗Goat Anti-Rabbit lgG H&L（HPR）（Abcam公司，英国）;红外线荧光二抗Anti-rabbit IgG（H+L）（CST公司，美国）;TBGreenTM Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）（Takara公司，日本）;Odyssey雙色红外荧光扫描成像系统（LI-COR公司，美国）;荧光PCR仪StePonePlus（Applied Biosystems，美国）。

1.2实验动物

SPF级雄性SD大鼠32只（大鼠8W龄，体重180±20g），购自广西医科大学实验动物中心（动物许可证号：SCXK 20090002）。动物于通风良好，温度22～28℃，湿度为40%～60%，12小时光照/暗光的室内条件下饲养。

1.3方法与步骤

购买的动物进行环境适应性饲养2周后，将其随机分成对照组、GSK'872对照组、锰中毒组、GSK'872干预组、每组8只;锰中毒组、GSK'872干预组大鼠经腹腔注射（ip）MnCl2·4H20 （15mg/kg，每周5天，共4w）建立亚急性锰中毒模型。同时对照组、GSK'872对照组腹腔注射等容量生理盐水。动物在进行腹腔染锰期间，GSK'872干组、GSK'872对照组于每周的第3日向小脑延髓池内缓慢注射GSK'872，每次10 ul（25 mM，每周1天，共3w），锰中毒组和对照组则向小脑延髓池内注射等量生理盐水。最后剔除不合格的动物，对照组剩余8只、GSK'872对照组剩余7只、锰中毒组剩余6只，GSK'872干预组剩余7只。锰及小脑延髓池注射药物期间每日观察大鼠一般情况、每周称重2～3次并根据体重上下调整染锰剂量。

1.4样本取材

小脑延髓池及腹腔染锰给药4w结束后继续饲养3w。取材：每组动物取6只提取组织蛋白和RNA，动物在深度麻醉下采用颈椎脱臼法处死取脑，分离双侧的脑海马及黑质组织，置于超低温冰箱备用。

1.5样本检测

1.5.1Western blot检测大鼠黑质TH及海马组织GFAP表达的变化。

脑组织添加高效RIPA组织裂解液，提取总蛋白。BCA法测定蛋白质浓度，以计算上样量。配制电泳凝胶进行蛋白电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，用1×TBST清洗后用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，置入一抗（GFAP 1：2 000，TH 1：2000 ，β-actin1：5 000）中室温下孵育 4～6 h， 4 ℃过夜。次日1×TBST清洗后孵育二抗Anti-rabbit IgG（H+L）（1：30000）后，1×TBST清洗后在双色红外荧光扫描成像系统中扫描，进行免疫印迹观察检测，用Odyssey软件进行数据分析，以β-actin作为内参计算各组GFAP、TH的相对表达量。

1.5.2 RT-qPCR法檢测海马与黑质RIP3基因的表达

用RNA总试剂盒提取皮层和海马组织样品RNA，并检测RNA浓度和纯度合格后进行逆转录。然后进行RT-qPCR法检测海马与黑质RIP3基因的表达。重复3次以上实验，最后用Stepone Software进行数据分析，各基因相对表达量采用2-△△Ct值表示。

2、统计学分析

数据资料采用SPSS23.0统计软件进行分析。用x±s表示阳性细胞数及蛋白表达量和基因表达量。各组间的均数差异以方差分析的最小显著差异法（LSD）检验，如方差不齐则选择Tamhane’s T2 进行校正检验，检验水准设为α=0.05。

3、结果

3.1GSK'872对亚急性锰暴露大鼠海马GFAP、黑质TH表达的影响

（1）由表3-1，图A，B可见，与对照组比较，染锰组大鼠GFAP蛋白表达水平升高（P < 0.05），TH表达水平降低;与染锰组比较，GSK'872干预组GFAP蛋白表达水平均降低（P< 0.05），TH表达水平降升高（P < 0.05）。

3.2 GSK'872对亚急性锰暴露大鼠海马RIP3基因表达的影响

由表3-2可见，与对照组比较，染锰组大鼠海马、黑质RIP3表达水平均升高（P < 0.05）;与染锰中毒组比较，GSK'872干预组海马RIP3表达水平均降低（P < 0.05）。

4、讨论

星形胶质细胞（AS）在生理和病理条件下与神经元的相互作用对大脑结构和生理功能的维持均有着重要的影响作用，大脑锰最多富集于星形胶质细胞的线粒体内并干扰其功能，导致细胞能量代谢障碍[10，11]。反应性星形胶质细胞增多不仅与星形胶质细胞功能受损有关，还可增强组织的氧化应激及炎症反应 [12]，损害多巴胺能等神经元的细胞代谢及功能。本研究的观察到锰暴露后大鼠脑海马的GFAP的表达随即上调，黑质多巴胺神经元的神经递质合成功能障碍，这与多个文献报道的结果相似。将GSK’872注入染锰大鼠的小脑延髓池后，海马组织内AS的反应水平下降，多巴胺神经元的TH表达明显回升，同时染锰后海马组织内表达升高的RIP3、基因表达也有明显下调，提示GSK’872可能具有一定拮抗锰神经毒性的作用，其原因可能与GSK’872能特异性阻断细胞的坏死样凋亡的发生有关。

星形细胞与神经元的相互作用在脑内的生理平衡中十分重要，特别是通过神经递质循环功能，如AS与神经元之间的Gln-Glu-GABA循环（GGG循环）。AS的功能受损与过度活化在锰的神经毒理机制中具有复杂多样的作用。锰能诱导AS炎症产物和信号转导介质的表达，增加一氧化氮（NO）底物、L-精氨酸在AS中的转运及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的合成[13];活化的AS还能增加水通道蛋白aquaporin-4（aqp4）的表达，与锰介导的细胞肿胀有关[14]。与此同时，锰和多巴胺在脑内的相互作用可增加多巴胺能细胞的受损程度。由于锰中毒诱导的细胞坏死可因细胞裂解释放出胞内含物常引起炎症反应，增强星形细胞与神经元之间异常的相互作用，故在分子水平抑制细胞坏死的发生，理论上具有一定拮抗锰神经毒性的作用，GSK’872在本实验中表现出具有下调脑内AS异常的活化水平、提高多巴胺能神经元功能的作用。

近年来有关程序性细胞坏死机制在神经系统疾病中的作用不断受到关注。Yang等[15]发现将GSK'872注入侧脑室可减轻动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）模型动物的脑水肿、减少脑海马神经细胞坏死的，并降低促炎蛋白HMGB1的表达;GSK'872可减轻MCAO模型大鼠脑神经细胞坏死的程度。应用Necrostatin-1，GSK'872或MLKL抑制剂necrosulfonamide（NSA）或相应基因的敲低能减轻连续机械应力诱导大鼠髓核细胞的发生坏死性凋亡[16]。

综上所述，锰中毒的引起的星形胶质细胞早期的活化水平升高及黑质多巴胺能神经细胞的功能障碍与坏死样凋亡确有可能存在相关的关系，GSK’872能特异性抑制神经组织细胞坏死样凋亡，在一定程度上能减轻因细胞坏死引发神经组织的炎症反应，降低组织的氧化应激水平，它与其衍生物可能是一类预防和治疗锰中毒等神经系统疾病的潜在药物。

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作者简介：何莲瑜（1991.3-），女，壮族，广西凭祥人，广西医科大学硕士研究生，主要研究方向：神经毒理学。

通讯作者：邓祥发。